PPT 4

Question 1

Para além de Y2H, que outras identificações experimentais de PPIs se podem fazer?

Answer 1

• Purificação por afinidade + espetrometria de massa
• Co-imunoprecipitação
• Pull-down
• Cristalografia por raios X
• ensaios enzimáticos

Question 2

A sensibilidade e especificidade da purificação por afinidade depende de;

Answer 2

• força e estabilidade das interações das proteínas envolvidas
• abundância absoluta e relativa de proteínas presa

Question 3

Como funciona a purificação por afinidade?

Answer 3

1. Isco é imobilizado
2. mistura de proteínas passa e apenas as presas são retidas
3. presas são removidas, digeridas com proteases e respetivos peptideos analisados em MS

Question 4

Assim como a Y2H, a purificação por afinidade também é …

Answer 4

high throughput

Question 5

Quais as vantagens da purificação por afinidade?

Answer 5

• Deteta várias proteínas
• deteta proteínas complexas
• determina interações entre múltiplas proteínas
• as presas estão no seu estado nativo

Question 6

Quais as desvantagens da purificação por afinidade?

Answer 6

• não deteta relações binárias de proteínas
• Presas sem um peptideo sinal/presente em quantidades pequenas não vão ser identificada
• Interações transientes e/ou fracas não podem não ser detetadas

Question 7

A co-imunoprecipitação é feita em grande/pequena escala.

Answer 7

Pequena

Question 8

Como funciona a co-imunoprecipitação?

Answer 8

• Antigénio é escolhido para se ligar a uma proteína conhecida
• Pensa-se que esta proteína conhecida faça parte de um complexo cujas partes estejam presentes na solução
• espera-se recolher o complexo criado e identificar as proteínas desconhecidas do complexo

Question 9

As vantagens e desvantagens da co-imunoprecipitação são semelhantes às da técnica de…

Answer 9

purificação por afinidade

Question 10

Da mesma forma que Y2H e purificação por afinidade, a co-imunoprecipitação é …

Answer 10

high-throughput

Question 11

Como funciona o método pull-down?

Answer 11

• ligando + isco e mistura de protas + presa
• Incubação da mistura
• Presa liga-se ao isco
• lavagem da solução
• ligando sai e presa+isco são resolvidos em SDS-PAGE ou Western Blot

Question 12

Quais são as diferenças entre o pull-down e a co-imunoprecipitação?

Answer 12

• co-imunoprecipitação usa anticorpos imobilizados
• pull-down usa bait purificado e tagged para interagir com proteínas

Question 13

O que é o controlo positivo no pull-down?

Answer 13

Isco sozinho para verificar se há ligação do isco tagged ao suporte

Question 14

Como se eliminam falsos positivos no pull-down?

Answer 14

Mistura de protas passa numa outra coluna sem haver Isco. Ajuda a verificar se existem ligações sem afinidade ao isco

Question 15

Quais são as fontes de isco e presas para o pull-down?

Answer 15

• lisados celulares
• proteínas purificadas
• sistemas de expressão
• sistemas de transcrição e traduçáo in vitro

Question 16

A cristalografia por raios X produz fotografias…

Answer 16

3D da densidade de eletrões dentro do cristal

Question 17

A cristalografia por raios X dá detalhes … e …

Answer 17

estruturais e químicos

Question 18

Quais as vantagens da cristalografia por raios X?

Answer 18

• detalhes sobre as interações superficiais e dos resíduos
• dados de alta qualidase

Question 19

Quais as desvantagens da cristalografia por raios X?

Answer 19

• tecnica muito desafiadora
• low-throughout
• não está livre de falsos positivos e negativos
• nem todas as proteínas formam cristais
• nem todas as proteínas que cristalizam interagem a nível físico

Question 20

Para interações … pode-se usar ensaios enzimáticos.

Answer 20

transientes

Question 21

Quais as desvantagens dos ensaios enzimáticos?

Answer 21

• apenas dados in vitro
• requer proteínas puras
• possibilidade de um nº elevado de falsos positivos