POP 6 : IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS E GRAM-POSITIVAS Flashcards
Qual o objetivo de se isolar colônias ?
O método de isolamento de microrganismos é denominado Esgotamento do Inóculo, cujo objetivo é formar uma colônia pura a partir de uma única célula de determinado microrganismo.
“O princípio do método é que, quando se obtém uma cultura com muita carga microbiana, é necessário esgotar ou reduzir, ao máximo, essa carga para que se possa isolar o microrganismo
Como deve ocorrer o processo de isolamento de colônias?
1- Nos respectivos meios de cultura em que se encontram as bactérias, repique as colônias em duplicata,
utilizando alça de platina exclusiva para identificação. Obs.: Isole e arraste a colônia que esteja mais
isolada.Incube pos 24 horas a 30-35 °C;
2- Após 24 horas, realize a leitura das placas e descreva as colônias apresentadas nos meios;
3- Siga para o teste oxidade, no caso de bactérias desenvolvidas nos meios, Verde Brilhante, Mac Conkey e
Cetrimida (gram-negativas) e Vogel and Jonshon (gram-positivas);
4- Bactérias desenvolvidas nos meios Triptic Soy Agar (TSA), siga para a Técnica de Gram.
O que é o teste de oxidase?
O teste da oxidase é um teste-chave para diferenciar entre as famílias de Pseudomonadaceae (Oxidase positiva) e Enterobacteriaceae (Oxidase negativa), e útil para especificação e identificação de muitas outras bactérias, aquelas que têm de usar o oxigênio como o aceitador de elétrons final em respiração aeróbica.
O teste de oxidase é utilizado para verificar a presença ou a ausência da enzima citocromo oxidase.
O que é o teste de gram ?
A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactéricas que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas.
Como deve ocorrer o procedimento de coloração de Gram ?
1- Identifique 2 (duas) lâminas, previamente secas, para cada placa (incubadas anteriormente). Reserve um
béquer para lavagem das lâminas;
2- Para iniciar o Teste Gram e com auxílio do pipetador, coloque 1 (uma) gota de água purificada no meio da
lâmina;
3- Retire o mínimo de colônia possível e espalhe na gota de água colocada na lâmina;
4- Tenha o máximo de cuidado para fixar o esfregaço na chama.
5- Coloque violeta crista até cobrir o material e após 1 ( um) minuto escorra o excesso do violeta;
6- Em seguida, coloque lugol (mordente) e aguarde 30 segundo;
* Para descorar, lave com acetona ou álcool;
* Como contraste, coloque safranina ou fucsina e aguarde 1 (um) minuto;
* Lave com água purificada.
O que deve ocorrer após a identificação de bactérias gram-negativas?
Gram negativos (vermelho), siga para o Teste Oxidase, Indol, e o teste utilizando o sistema de identificação microbiana
conforme disponível da empresa (BBL, Vitek, outros) para bactérias gram-negativas;
O que deve ocorrer após a identificação de bactérias gram-positivas?
Gram positivos (roxo) e diferencie se é bacillus ou cocos e siga para o teste utilizando o sistema de identificação
microbiana conforme disponível da empresa (BBL, Vitek, outros) para bactérias gram-positivas;
Como deve ocorrer o teste de oxidase?
Técnica direta: placas. Adicione 2 a 3 gotas de reagente, diretamente sobre as colônias isoladas, as quais cresceram
em placas.
Técnica indireta: tiras de papel. Coloque algumas gotas na tira ou em discos comerciais impregnados com reagente e
as reserve para secar.
Retira-se a colônia da placa e faça o esfregaço na tira, junto à chama acesa; aguarde de 20 a 60 segundos para
comprovar o resultado.
Como deve ser analisado o resultado do teste de oxidase?
:Colônias que possuem atividade de citocromo oxidase, desenvolvem cor azul-escura no sítio de
inoculação, no tempo de 10 segundos. Entre o período de 10 a 60 segundos, provavelmente não pertence as
Enterobacteriaceae, não devendo ser utilizados filamentos de inoculação de aço inoxidável ou níquel-cromo,
porque os produtos da oxidação, formados após a esterilização em chama, podem produzir reações falsopositiva.
O que é o teste indol ?
O teste do Indol detecta a ação da enzima triptofanase ajudando na diferenciação de Enterobacteriaceae e
outros grupos de microorganismo. O teste do Indol determina a capacidade que o organismo tem em produzir
Indol através da degradação do aminoácido L-Triptofano em Indol, Ácido Pirúvico e Amônia.
Como deve ser feito o teste de Indol ?
Inocule os microorganismos, repicados anteriormente, em 20 mL de Caldo Casoy Pura para realizar o
teste Indol; essa inoculação também pode ser feita no caldo triptofano;
* Cuidado para não encostar a alça na parede do tubo, agite-o e incube por 48 horas a 30 – 35 °C;
* Após 48 horas na incubação, adicione 15 gotas do reagente de Kovacs nos tubos, deixando que as gotas escorram pela parede interna do tubo;
* Obs.: Caso utilize o reagente Ehrlich, essa etapa deve ser precedida pela adição de 1mL de xileno;
Como deve ser analisado o resultado do teste de Indol ?
O desenvolvimento de cor vermelho-fúcsia brilhante na interface do reagente e do meio líquido ou
da camada de xileno, após a adição do reagente, indica a presença de Indol, resultando em prova positiva.
Positivo: Aparecimento de uma anel de cor vermelha;
Negativo: O meio fica com uma cor amarela.
A indústria farmacêutica Neo Química, produz por Lote 1000 unidades de Doralgina® gotas, solução oral, frasco com 15 mL
Qual a quantidade do produto para realização do(s) teste (s), e como é feita a amostragem para que esta seja representativa do lote?
Salvo indicação em contrário, utilizar mistura de amostras contendo 10 g ou 10 mL do produto a
examinar. Utilizar 10 unidades para aerossol – forma líquida ou sólida e para dispositivos
transdérmicos.
Com base nos excipientes da formulação, é necessário algum neutralizante/inativante? Se sim, qual o melhor neutralizante?
(doralgina gotas)
Possui sorbitol em sua composição, para ela se aplica diluição.
O que são microorganismos mesófilos ?
São organismos capazes de se desenvolver em temperatura “ambiente” entre 25 e 40ºC
