POP 3 : TESTE DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO, SELETIVIDADE E ESTERILIDADE DOS MEIOS DE CULTURA Flashcards
Qual o objetivo do teste de esterilidade do meio de cultura?
verificar ausência de crescimento de microrganismos no meio de cultura,
demonstrando que estão isentos de contaminação microbiana, demonstrando que o processo de
esterilização foi bem sucedido.
Como ocorre o teste de esterilidade do meio de cultura?
Após esterilização, selecionar 02 unidades e incubar nas temperaturas de 30-35°C (meios destinados e crescimento de bactérias) pelo período de 03 dias
ou 20-25°C para meios destinados a crescimento de fungos e leveduras, pelo período de 05 dias.
-.Fazer a leitura das placas e tubos.
- No resultado do teste de esterilidade não deve haver crescimento de microrganismo.
Qual o objetivo do teste de promoção de crescimento no meio de cultura?
verificar a viabilidade dos meios de cultura quanto a capacidade de promover o
crescimento de microrganismos teste correspondente a cada meio, com isso pode comprovar que o meio de
cultura mantém as suas características originais (prazo de validade/ armazenamento correto / qualidade dos
nutrientes do meio, dentre outros) e que a preparação deste meio foi corretamente realizada (cálculo e
pesagem correta, não houve excesso de esterilização provocando caramelização do açúcar, dentre outros).
Como são avaliados (em relação ao teste de promoção de crescimento ) os Meios utilizados para a contagem microbiana de bactérias/leveduras ou fungos?
são avaliados em relação à quantidade de crescimento de colônias, os quais não devem ser menor que 50% do inóculo teste.
(Ágar caseína-soja com ou sem neutralizante, Ágar sabouraud-dextrose com ou sem neutralizante, Ágar
triptona extrato de levedura
Meios utilizados para pesquisa de patógenos (seletivos): são avaliados
quanto às características das colônias. (Ágar Mac Conckey, Ágar XLD, Ágar Cetrimida, Ágar Sal Manitol,
Ágar Chromocult, Ágar Pseudomonas).
Qual o procedimento do teste de promoção de crescimento ?
1- No preparo de qualquer meio de cultura para o teste, identificar o lote, validade, microrganismo teste
adicionado, responsável e preencher o RQ apropriado;
2- Preparo do inóculo : as cepas veem liofilizadas pelo fornecedor. Elas precisam ser reidratadas com 1 ml de cloreto de sódio
3- Colocar as cepas reidratas em tubo com 9ml de caldo caseína-soja
4- Incubar em temperatura de 30-35 °C durante 24 horas para bactérias e 20-25 °C durante 48 horas para fungos.
5- Após incubação fazer repique pela técnica de esgotamento em placas com TSA para bactérias ( a 30-35°C durante 24 horas)
e ágar Sabouraud-dextrose para fungos (20-25°C durante 48 horas)
6- analisar o crescimento
Qual destino pode ser dado aos microorganismos que cresceram em placa no teste de promoção de crescimento?
Após crescimento dos microrganismos na placa de Petri, pode-se usar este microorganismo para o ensaio propriamente dito, por meio da padronização do inóculo (diluição seriada) e /ou pode-se partir para o armazenamento desta cepa em cepas estoque
Como ocorre o armazenamento das cepas resultantes do teste de promoção de crescimento ?
para isso uma das alternativas é se
fazer um segundo repique em tubos inclinados e incubar a 30-35°C durante 24 horas para bactérias e 20-25°C durante 48 horas para fungos, verificando o crescimento nos tubos acrescentar óleo mineral até cobrir todo o repique (crioprotetor, ou seja, proteje as colônias quanto ao ressecamento
pelo frio), identificar o tubo com etiqueta e acondicionar em geladeira/freezer (temperatura indicada
para armazenamento da cepa de origem: conferir no laudo).
Como ocorre a diluição seriada para padronização de inóculo das cepas resultantes do teste de promoção de crescimento ?
Para esse procedimento, são usados os tubos com ágar inclinada que funcionaram como cepa estoque.
1-O óleo mineral é retirado do tubo,
2- é adicionado cerca de 2ml de cloreto de sódio
3- A solução é agitada para se obter uma dispersão microbiana
4- transferir 1ml da dispersão para outro tubo contendo 9ml de caldo caseína-soja
5- Incubar 30-35°C durante 24 horas para bactérias e 20-25°C durante 48 horas para fungos, após este
período temos uma suspensão microbiana. (Obtem-se a suspensão mãe = 100)
6- Realizar diluições seriadas de 10-1 até 10-8 adicionar em 8 tubos de ensaio 9mL da solução cloreto de sódio 0,9%.
7- Guardar a suspensão microbiana mãe (100)na geladeira para uso posterior
8- Separar as três ultimas diluições, transferir as alíquotas de 1 mL para placas de petri, em triplicata adicionar 20 mL de TSA, para contagem de bactérias e 20 mL de ágar Sabouraud-dextrose para fungos. (técnica de profundidade)
9- Incubar a 30-35°C durante 24 horas para bactérias e 20-25°C durante 48 horas para fungos. Após o
período de incubação, realizar a contagem das UFC’s das placas no contador de colônia. A diluição
que obtiver cerca de 100 UFC será utilizada 1 mL nos meios de cultura destinados e contagem de
bactérias, leveduras ou fungos
Como é avaliado os resultados para teste de promoção de crescimento em meio de cultura seletivo ?
Para o teste de fertilidade de meios seletivos, o prodecimento pode ser igual ao descritos para os meios nãoseletivos, partindo da dluição seriada, contudo não há necessidade de contar as colônias e a recuperação
destas ser igual ou maior que 50% da UFC inoculadas, pois o resultado é expresso pelo crescimento das
colônias com as características específicas para cada cepa. Consequentemente fica a compreensão que
este teste poderia partir de uma diluição não padronizada como a diluição seriada, ou seja partir de uma
suspensão 10-1 ou 10-2 e apenas monitorar as características específicas para cada cepa, contudo o
crescimento de colônias na placa pode ser muito intenso o que dificulte a visualização adequada das
colônias, devido a um crescimento exarcebado.
Qual o objetivo do teste de seletividade dos meios de cultura?
verificar a inibição de microrganismos teste, demonstrando a habilidade de
inibição do meio seletivo, com ausência de crescimento.
A preparação do Inóculo é realizada conforme descrito anteriormente, o que muda neste caso é que o teste
não é quantitativo. O teste é qualitativo, ou seja, ele quer avaliar a capacidade de inibição e não a
recuperação. Por isso não é necessário se fazer a diluição seriada para se descobrir qual é a diluição que
contém aproximadamente 100 UFC. Neste caso quanto maior for o número de colônias inoculadas mais
desafiado o meio de cultura será, pois terá que inibir o crescimento de um maior número de microrganismos.
Como ocorre o procedimento do teste de seletividade em meio de cultura?
1- Partindo da suspensão mãe (100), seja de origem liofilizada ou cepa estoque em óleo mineral, retirar 1 mL
desta suspensão e transferir para tubo de ensaio contendo 9 mL de cloreto de sódio 0,9% (diluição 10-1)
2- A partir da suspensão microbiana 10-1 realizar o repique com auxilio da alça de platina para as placas de
petri contendo o meio de cultura SÓLIDO (ágar) ou LÍQUIDO(caldo) dos microrganismos destinados ao teste
de seletividade, em triplicata.
3- Incubar as placas a 30-35°C durante 3 dias(observe que todos os meios ÁGAR e CALDO seletivos utilizam
meio para bactérias e por isso não há incubação em outras condições que não sejam para bactérias).
4-Após o período de incubação, realizar a leitura das placas ou tubos destinadas ao teste de seletividade. Registrar em RQ apropriado.
