Plasmide, digestion d'ADN, principes de clonage et purification des plasmides par lyse alcaline et PCR

Question 1

Nommer les caractéristiques des plasmides

Answer 1

• Petites molécules d’ADN double-brin extra-chromosomiques
• Molécules circulaires (normalement super-enroulées)
• Capables de se répliquer de façon indépendante du chromosome
• Souvent porteurs de gènes de résistance à des antibiotiques
• Outils de base du génie génétique
• Souvent modifiés pour inclure un site de clonage multiple

Question 2

Pour décrire les plasmides dans les schémas il y a des symboles. Que signifie les flèches? Les lignes verticales? Nom des gènes?

Answer 2

• Les flèches indiquent le sens de la transcription
• Lignes verticales indiquent les sites de coupure par les enzymes de restriction
• Nom des gènes : il s’agit d’un gène de résistance au antibiotiques par exemple

Question 3

Qu’est-ce que des enzymes de restriction?

Answer 3

Elles reconnaissent et coupent une séquence spécifique d’ADN

Question 4

Vrai ou Faux? La longueur du site de reconnaissance est toujours la même.

Answer 4

Faux, la longueur peut varier, souvent 4 ou 6 pb

Question 5

Vrai ou Faux? Les sites de reconnaissance sont souvent palindromiques.

Answer 5

Vrai, on retrouve la même séquence si on la lit de 5’ vers 3’ sur le brin maître et le brin complémentaire

Question 6

Donner un exemple de 5’ protubérantes.

Answer 6

5’ G AATTC 3’

3’CTTAA G 5’

Question 7

Est-ce que EcoR 1 est un hétérodimère ou un homodimère?

Answer 7

Homodimère

Question 8

Lorsqu’il y a introduction d’un plasmide dans une cellule bactérienne que ce passe-t-il?

Answer 8

On pourrait constater un nouveau phénotype associé au fragment d’ADN cloné s’il contient un gène

Question 9

Qu’est-ce que la transformation chez les bactéries?

Answer 9

C’est l’étape d’insertion d’un plasmide dans un hôte.

S’il s’agit d’un clonage, on introduit le mélange de ligation

Question 10

Qu’est-ce que le repiquage des clones?

Answer 10

Il s’agit de repiquer différentes colonies sur un autre pétri (on les nomme “clones) et ensuite obtenir des cultures liquides de chacun des clones afin d’isoler l’ADN plasmidique
On obtient une préparation d’ADN plasmique correspondant à une seule possibilité du clonage

Question 11

Sous quelle forme est l’ADN plasmidique dans les cellules?

Answer 11

Super-enroulée

Question 12

À quoi sert la lyse alcaline?

Answer 12

Isoler et purifier l’ADN plasmidique à partir d’un bouillon de culture

Question 13

À quoi sert le pH alcalin dans la lyse alcaline?

Answer 13

Dénaturer les protéines, les liaisons hydrogènes entre les brins d’ADN sont brisées.

Question 14

Est-ce que les 2 brins d’ADN se sépare physiquement lors des étapes de purification?

Answer 14

Non, car l’ADN plasmidique est super-enroulé.

Question 15

Après l’ajout de la solution de neutralisation est-ce que l’ADN chromosomique reprend sa forme initiale? L’ADN plasmidique?

Answer 15

L’ADN chromosomique n’est pas capable de reprendre sa forme initiale et demeure complexé aux débris de protéines dénaturées et insolubles.
L’ADN plasmidique retrouve sa forme double-brin native et demeure soluble.

Question 16

Après l’ajout de la solution de neutralisation et après une centrifugation, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomique se retrouvent dans quelle partie de la solution?

Answer 16

ADN plasmidique = surnageant

ADN chromosomique = culot

Question 17

Après l’ajout d’éthanol 70% et après une centrifugation, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomique se retrouvent dans quelle partie de la solution?

Answer 17

ADN plasmidique = culot
ADN chromosomique = surnageant
L’éthanol élimine le sel qui a précipité avec l’ADN

Question 18

Après l’ajout d’éthanol 95% froid et après une centrifugation, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomique se retrouvent dans quelle partie de la solution?

Answer 18

ADN plasmidique = culot
ADN chromosomique = surnageant
L’éthanol fait précipité l’ADN

Question 19

Qu’est-ce que le principe de la PCR?

Answer 19

Technique de synthèse de fragments d’ADN linéaires qui permet d’amplifier de milliards de fois une séquence cible.

Question 20

Quelles sont les réactifs a mettre dans un microtube pour la PCR?

Answer 20

• Tampon pour l’enzyme ( avec Mg2+)
• dNTPs (mélange de 4 déoxynucléotides)
• Oligonucléotide 1 (amorce forward)
• Oligonucléotide 2 (amorce reverse)
• ADN polymérise thermostable (Taq)
• ADN à amplifier ou ARN

Question 21

Décrire le principe de la PCR

Answer 21

1)Dénaturation à 95C pour séparer les 2 brins
2) Température est abaissé pour l’appariement des amorces (60C)
3) Température augmenter à 72C (Optimale pour l’activité de la Taq)
Fin du premier cycle (répété plusieurs fois)

Question 22

On répète les cycles d’amplification combien de fois?

Answer 22

Environ 30. L’amplification d’amplicons est exponentielle. L’amplicon devient le fragment d’ADN le plus abondant dans le tube afin de faciliter sa détection

Question 23

Que se passe-t-il si la température est trop basse lors de l’appariement des amorces?

Answer 23

Les amorces vont s’apparier avec une cible partiellement complémentaire et génère des amplicons non spécifique

Question 24

Que se passe-t-il si la température est trop haute lors de l’appariement des amorces?

Answer 24

Les amorces ne s’apparient pas et on n’obtient pas d’amplicon

Question 25

Vrai ou Faux? La quantité d’ADN synthétisé est illimité.

Answer 25

Faux. Sa quantité est limitée généralement à quelques microgrammes d’ADN, car les nucléotides et les amorces sont présentes en quantité limitée dans le tube

Question 26

Vrai ou Faux? Après un certain nombre de cycles, on n’obtiendra pas plus d’amplicons même en continuant les cycles du thermocycleur.

Answer 26

Vrai.

Question 27

Vrai ou Faux? Cette méthode (PCR) permet facilement de quantifier la quantité de cible d’ADN que contenait le tube.

Answer 27

Faux. Tous les tubes contenant la cible donneront le même signal à la fin.
Ex : 100 copies de la cible = 1 ug d’ADN après 30 cycles
1 copie de la cible = 1 ugd’ADN après 30 cycles

Question 28

À quoi sert la technique de PCR quantitatif ?

Answer 28

Permet de déterminer combien il y avait de copies de l’ADN cible au départ

Question 29

Décrire le principe du PCR quantitatif.

Answer 29

Le tube qui contient le mélange réactionnel et un réactif qui va émettre de la fluorescence si l’amplicon est synthétisé. Le thermocycleur va mesurer l’intensité de la fluorescence de chacun des tubes

Question 30

Vrai ou Faux? La quantité d’amplicon double à chacun des cycles.

Answer 30

Vrai. Voir exemple diapo 33 !!