Plasmide, digestion d'ADN, principes de clonage et purification des plasmides par lyse alcaline et PCR Flashcards
Nommer les caractéristiques des plasmides
- Petites molécules d’ADN double-brin extra-chromosomiques
- Molécules circulaires (normalement super-enroulées)
- Capables de se répliquer de façon indépendante du chromosome
- Souvent porteurs de gènes de résistance à des antibiotiques
- Outils de base du génie génétique
- Souvent modifiés pour inclure un site de clonage multiple
Pour décrire les plasmides dans les schémas il y a des symboles. Que signifie les flèches? Les lignes verticales? Nom des gènes?
- Les flèches indiquent le sens de la transcription
- Lignes verticales indiquent les sites de coupure par les enzymes de restriction
- Nom des gènes : il s’agit d’un gène de résistance au antibiotiques par exemple
Qu’est-ce que des enzymes de restriction?
Elles reconnaissent et coupent une séquence spécifique d’ADN
Vrai ou Faux? La longueur du site de reconnaissance est toujours la même.
Faux, la longueur peut varier, souvent 4 ou 6 pb
Vrai ou Faux? Les sites de reconnaissance sont souvent palindromiques.
Vrai, on retrouve la même séquence si on la lit de 5’ vers 3’ sur le brin maître et le brin complémentaire
Donner un exemple de 5’ protubérantes.
5’ G AATTC 3’
3’CTTAA G 5’
Est-ce que EcoR 1 est un hétérodimère ou un homodimère?
Homodimère
Lorsqu’il y a introduction d’un plasmide dans une cellule bactérienne que ce passe-t-il?
On pourrait constater un nouveau phénotype associé au fragment d’ADN cloné s’il contient un gène
Qu’est-ce que la transformation chez les bactéries?
C’est l’étape d’insertion d’un plasmide dans un hôte.
S’il s’agit d’un clonage, on introduit le mélange de ligation
Qu’est-ce que le repiquage des clones?
Il s’agit de repiquer différentes colonies sur un autre pétri (on les nomme “clones) et ensuite obtenir des cultures liquides de chacun des clones afin d’isoler l’ADN plasmidique
On obtient une préparation d’ADN plasmique correspondant à une seule possibilité du clonage
Sous quelle forme est l’ADN plasmidique dans les cellules?
Super-enroulée
À quoi sert la lyse alcaline?
Isoler et purifier l’ADN plasmidique à partir d’un bouillon de culture
À quoi sert le pH alcalin dans la lyse alcaline?
Dénaturer les protéines, les liaisons hydrogènes entre les brins d’ADN sont brisées.
Est-ce que les 2 brins d’ADN se sépare physiquement lors des étapes de purification?
Non, car l’ADN plasmidique est super-enroulé.
Après l’ajout de la solution de neutralisation est-ce que l’ADN chromosomique reprend sa forme initiale? L’ADN plasmidique?
L’ADN chromosomique n’est pas capable de reprendre sa forme initiale et demeure complexé aux débris de protéines dénaturées et insolubles.
L’ADN plasmidique retrouve sa forme double-brin native et demeure soluble.
Après l’ajout de la solution de neutralisation et après une centrifugation, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomique se retrouvent dans quelle partie de la solution?
ADN plasmidique = surnageant
ADN chromosomique = culot
Après l’ajout d’éthanol 70% et après une centrifugation, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomique se retrouvent dans quelle partie de la solution?
ADN plasmidique = culot
ADN chromosomique = surnageant
L’éthanol élimine le sel qui a précipité avec l’ADN
Après l’ajout d’éthanol 95% froid et après une centrifugation, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomique se retrouvent dans quelle partie de la solution?
ADN plasmidique = culot
ADN chromosomique = surnageant
L’éthanol fait précipité l’ADN
Qu’est-ce que le principe de la PCR?
Technique de synthèse de fragments d’ADN linéaires qui permet d’amplifier de milliards de fois une séquence cible.
Quelles sont les réactifs a mettre dans un microtube pour la PCR?
- Tampon pour l’enzyme ( avec Mg2+)
- dNTPs (mélange de 4 déoxynucléotides)
- Oligonucléotide 1 (amorce forward)
- Oligonucléotide 2 (amorce reverse)
- ADN polymérise thermostable (Taq)
- ADN à amplifier ou ARN
Décrire le principe de la PCR
1)Dénaturation à 95C pour séparer les 2 brins
2) Température est abaissé pour l’appariement des amorces (60C)
3) Température augmenter à 72C (Optimale pour l’activité de la Taq)
Fin du premier cycle (répété plusieurs fois)
On répète les cycles d’amplification combien de fois?
Environ 30. L’amplification d’amplicons est exponentielle. L’amplicon devient le fragment d’ADN le plus abondant dans le tube afin de faciliter sa détection
Que se passe-t-il si la température est trop basse lors de l’appariement des amorces?
Les amorces vont s’apparier avec une cible partiellement complémentaire et génère des amplicons non spécifique
Que se passe-t-il si la température est trop haute lors de l’appariement des amorces?
Les amorces ne s’apparient pas et on n’obtient pas d’amplicon
Vrai ou Faux? La quantité d’ADN synthétisé est illimité.
Faux. Sa quantité est limitée généralement à quelques microgrammes d’ADN, car les nucléotides et les amorces sont présentes en quantité limitée dans le tube
Vrai ou Faux? Après un certain nombre de cycles, on n’obtiendra pas plus d’amplicons même en continuant les cycles du thermocycleur.
Vrai.
Vrai ou Faux? Cette méthode (PCR) permet facilement de quantifier la quantité de cible d’ADN que contenait le tube.
Faux. Tous les tubes contenant la cible donneront le même signal à la fin.
Ex : 100 copies de la cible = 1 ug d’ADN après 30 cycles
1 copie de la cible = 1 ugd’ADN après 30 cycles
À quoi sert la technique de PCR quantitatif ?
Permet de déterminer combien il y avait de copies de l’ADN cible au départ
Décrire le principe du PCR quantitatif.
Le tube qui contient le mélange réactionnel et un réactif qui va émettre de la fluorescence si l’amplicon est synthétisé. Le thermocycleur va mesurer l’intensité de la fluorescence de chacun des tubes
Vrai ou Faux? La quantité d’amplicon double à chacun des cycles.
Vrai. Voir exemple diapo 33 !!