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Laboratoire Biochimie > Électrophorèse des acides nucléiques > Flashcards

Électrophorèse des acides nucléiques Flashcards

1
Q

Quelles sont les applications courantes de l’électrophorèse des acides nucléiques?

A
  • Mesurer la taille d’un fragment d’ADN linéaire
  • Analyser des produits de digestion avec une enzyme de restriction
  • Analyser des produits d’amplification d’ADN par PCR
  • Séparer les molécules d’ADN ou d’ARN en prévision d’un buvardage
  • Isoler et purifier un fragment d’ADN
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Q

“f” (coefficient de friction) dépend de quoi?

A
  • Taille de la molécule
  • Forme de la molécule
  • Viscosité du milieu
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3
Q

On détermine la taille des acides nucléiques par leur nombre de nucléotides (pb) ou en Daltons?

A

Par leur nombre de nucléotides, les Daltons c’est pour les protéines.

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4
Q

Vrai ou Faux? La quantité d’ADN (ng ou ug) d’un échantillon n’indique pas sa taille.

A

Vrai.

Ex : Fragment de 500 -b vs fragment de 5000 pb (10 x moins de molécules ou de moles pour la même masse

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Q

Vrai ou Faux? Le ratio charge/masse des acides nucléiques est constant et la charge nette est négative à pH 8.

A

Vrai. La charge est apportée par chaque groupement phosphate de chacun des nucléotides, la charge augmente de manière proportionnelle à la taille.

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6
Q

La possibilité de séparer les acides nucléiques repose sur quoi?

A

Sur une différence de forme (conformation) et de taille

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7
Q

Qu’est-ce qui dicte le choix du support à utiliser?

A

La taille des acides nucléiques.

Le gel d’agarose est souvent employé et sa concentration est choisie en fonction de la taille des fragments à séparer.

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8
Q

Si on veut séparer des petits fragments d’ADN qu’elle gel sera employé?

A

Le gel de polyacryamide

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9
Q

Qu’est-ce que l’agarose?

A

C’est un polymère linéaire non-ramifié de galactose

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10
Q

Le gel préparé avec l’agarose “low melting” est utile pour quoi?

A

Pour purifier un fragment d’ADN après une électrophorèse

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11
Q

Décrire la procédure pour un gel d’agarose “low melting”

A
  • Découpe le gel là où est le fragment d’ADN désiré
  • On place le morceau dans un microtube
  • On place le tube dans un bain de 65C pour faire fondre le gel
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12
Q

Pourquoi est-ce que la concentration d’agarose est importante?

A

Elle influence la porosité du gel, donc son pouvoir de séparation des acides nucléiques selon leur taille

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13
Q

Un gel d’agarose 0,8% permet de séparé des tailles des molécules d’ADN de quelle taille?

A

500-15 000 pb

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14
Q

Vrai ou Faux? Plus la concentration est agarose est grande, plus la taille des molécules d’ADN séparée est grande.

A

Faux. C’est le contraire. Plus le pourcentage d’agarose est élevé, plus la taille des molécules est petite

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15
Q

Pourquoi est-ce que les gels d’agarose 0,8% sont souvent utilisées?

A

Parce que la plupart des fragments d’ADN manipulés ont quelques milliers de paires de bases (pb).

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16
Q

Classer en ordre de migration les molécules : Très grosses, grosses, petites molécules, très petites molécules.

A

Le plus en haut sont les très grosses molécules (N’entrent pas dans le gel) .Les grosses molécules entrent dans le gel mais ne sont pas séparées (elles migrent toutes au même endroit sur le gel, 25 000pb).
Les petites sont séparés et suivent la relation de linéarité entre le long de la taille vs distance de migration. Les très petites sont en bas complètement et ne sont pas sépares par le gel, soit plus petites que 100 pb.

17
Q

Définir ce qu’est un plasmide

A

Molécules circulaires et super-enroulées à cause des topoisomérases

18
Q

Vrai ou Faux? Le plasmide super-enroulé migre toujours plus vite et la forme relâchée est toujours la plus lente.

A

Vrai.

19
Q

Nommer les étapes de la préparation du gel.

A
  • Pesée l’agarose
  • Solubilisé l’arrose dans le tampon par chauffage 100C
  • Refroidissement (50C) avant de couler le gel dans le moule
  • Placer le peigne, attendre solidification
  • Retrait du peigne + ajout tampon électrophorèse
20
Q

Nommer l’étape du traitement des échantillons.

A

-Ajout de tampon de chargement à chacun des échantillons

21
Q

Qu’est-ce que contient le tampon lors du traitement des échantillons?

A
  • Glycérol pour augmenter la densité de l’échantillon pour qu’il coule dans le fond
  • Tampon
  • Colorant pour suivre la progression de l’électrophorèse
22
Q

Nommez les étapes de l’électrophorèse.

A
  • Dépôt des échantillons dans les puits
  • Branchement de l’appareil
  • Électrophorèse à 5V/cm (distance entre les 2 électrodes, pas la longue du gel)
  • Arrêt de l’électrophorèse quand le colorant arrive au 2/3 du gel
  • Enlèvement du gel + incubation de la solution de coloration si nécessaire
  • Visualisation aux UV
23
Q

Pourquoi ont utilise une électrophorèse sur gel d’agarose en conditions dénaturantes?

A

Pour éliminer l’effet de la conformation des acides nucléiques sur la vitesse de migration. Pour analyser des fragments d’ADN simple-brin ou d’ARN simple-brin selon leur taille

24
Q

Donner des exemples de gel d’agarose en conditions dénaturantes

A
  • Séquençage d’ADN
  • Buvardage de type “Northern blot”
  • L’électrophorèse en capillaire
  • Électrophorèse sur gel en gradient dénaturant
25
Q

Qu’est-ce qui différencie un gel en conditions dénaturantes de lui en conditions non-dénaturante?

A

En conditions dénaturantes : contient des agents dénaturants (urée) et l’électrophorèse est effectuée à haute température (50C)

26
Q

À quoi sert le buvardage Northern?

A
  • Séparation d’ARN sb en condition dénaturante
  • Transfert sur une membrane par buvardage
  • Détection par hybridation avec une sonde moléculaire
27
Q

À quoi sert l’électrophorèse capillaire?

A
  • Permet de séparer avec une très grande résolution les petits fragments d’ADN simple-brin
  • Typiquement utilisé pour le séquençage de première génération
28
Q

À quoi sert l’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant?

A
  • La présence d’un gradient d’agent dénaturant (urée) permet de séparer des fragments d’ADN de même taille mais de composition différente (séquence différentes)
  • Différencier des populations bactériennes par l’analyse d’amplification PCR de régions conservées du gène 16S
29
Q

Nommer des modifications de paramètres pour améliorer la capacité de résolution des gels en électrophorèse.

A
  • Composition du gel
  • Tampons
  • Champ électrique et l’orientation de ce champ
  • Température du gel
30
Q

À quoi sert l’électrophorèse en champs pulsé?

A

Permet la séparation des ADN de très grande taille comme des chromosomes

Laboratoire Biochimie (5 decks)

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