page 110-119 and 128-137

Question 1

1.what are transcription activators? what do they do

Answer 1

אלו פקטורי שעתוק, חלבונים, שתפקידם לעשות אקטיבציה לתהליך השעתוק

Question 2

מהו פקטור שעתוק gal4? איפה ניתן למצוא אותו?

Answer 2

הוא נמצא בשמרים. מדובר ב transcription activator

Question 3

מהו גן מדווח?

Answer 3

מדובר ברצף גנטי המדובר לית או בתוך רצף גנטי אותו חוקרים מעוניינים לחקור. כאשר הגן הזה משועתק לחלבון, הוא יכול ליצור קשר עם סובסטרט ולתת סימן כלשהו. למשל גן מדווח יכול להיות כזה שכשהוא נקשר עם הסובסטרט שלו יראו צבע כחול. כך ניתן לדעת כמה מהגן שבאמת מעניין אותנו שועתק

Question 4

כיצד חקרו את gal4? מה גילו?

Answer 4

מדובר בפקטור שעתוק מסוג transcription activator הכניסו גן מדווח בשם lac z ואז יצרו זנים מוטנטיםם של הגן gal4 כל פעם חתכו אותו מצד אחר, פעם מהנ’ טרמינלי ופעם מהס’ טרמינלי. גילו שלגן יש שני חלקים, אחד שקושר אותו לדנא, ואחר שקשור להפעלת השעתוק. עם לוקחים מכל החלבון רק את החומצות אמיניות הרלוונטיות האלה נקבל גם קשירה לדנא וגם תחילת שעתוק למרות שהגן ארוך מאוד. הדומיינים נקראים 1.DNA binding domain 2.Activating domain בניסוי המדובר הביינדינג דומיין היה ב74 הח”א הראשונות והאקטיבייטינג ב126-189 ח”א

Question 5

לפקטור השעתוק gal4 יש שני דומיינים חשובים - אחד שקושר דנא ואחד שעושה אקטיבציה לשעתוק. למה צריך את כל החומצות אמיניות שבאמצע?

Answer 5

אלו איזורי בקרה. אנו יודעים למשל שרק האיזורים האלו רלוונטים במצב מסויים. אך ייתכן שבמצבי רעב יהיה צורך גם באיזורים שבאמצע.

Question 6

what are enhancers? where are they found?

Answer 6

אנהנסרים הם קטעים בדנא אליהם נקשרים אקטיבטורים שעושים הגברה לשעתוק. הם יכולים להיות רחוקים מאיזור התחלת השעתוק (בגלל קיפול אפשרי של דנא).

Question 7

מה המנגנון באמצעותו אקטיבטורים מגבירים את שעתוק הרנא? איך הדבר קשור לספציפיות?

Answer 7

לכל אקטיבטור יש צד אחד שנקשר לדנא (לחלק מסויים של אנהנסר) וצד אחר שנקשר ל GTF של הרנא פולימרז. הקישור הזה מאפשר לרנא פולימרז לשהות יותר זמן באיזור הרצוי, ומחזק את הקשר בין הרנא פולימרז ל גתפ שלו. מבחינת ספציפיות, היעדרותו של אקטיבטור מסויים יכולה לפגוע בשעתוק ב5-10 אחוזים. כאשר נעשה פוספורילציה לאקטיבטור כלשהו יכול להיות שהוא לא יופיע, וכך נוכל לשנות את מידת השעתוקק של חלבון מסויים

Question 8

what is modulation?

Answer 8

היכולת להגיע לספציפיות מאוד גדולה לגבי כמה האקטיבטורים יאקטבו את השעתוק באמצעות קומבינטוריקה. כמו שרואים בתמונה הרעיון הוא שהאקטיבטורים צהוב-סגול ביחד (כדימר) בעלי יציבות שונה מאדום-צהוב למשל. כך על ידי שילוב של הרבה אקטיבטורים שבנויים כמונומרים ביחד לדימרים, נוכל לבחור כמה נאקטב את השעתוק. לדוגמא אם אדום-צהוב מאוד יציב ונרצה הרבה מהחלבון, נשתמש בהרבה דימרים של אדום-צהוב כאקטיבטורים. (תמונה 1)

Question 9

what is an inhibitor of a transcription activator? how does it work?

Answer 9

אינהיביטור הוא מעכב. בתמונה אפשר לראות למשל שהוא נקשר לפקטור הצהוב ולא מאפשר לו להקשר לדנא. הרעיון ההוא יהיה פיינ טיונינג מכיוון שהוא יכול לדעת להקשר גם רק לסוג אחד של מונומר, ואז דימריםאחרים ישארו וימשיככו לאקטב את השעתוק.

Question 10

האם ניתן להפוך אינהיביטור לאקטיבטור בצורה מלאכותית?

Answer 10

אפשר להוסיף לו באופן מלאכותי אקטיבייטינג דומיין. אקטיבציה ורפרסיה הם בעצם שני צדדים של אותו מטבע - לשניהם יש יכולת להקשר לדנא ולהשפיע על פקטורי השעתוק הכלליים (תמונה 2)

Question 11

אילו סוגי מעכבים יש ל transcription activators?

Answer 11

עיכוב תחרותי, עיכוב על ידי אינטראקציה בין פקטור מאקטב לפקטור מעכב, ועיככוב על ידי אינטראקציה עם פקטורי שעתוק כלליים. עיכוב תחרותי - האקטיבטור והרפרסור מתחרים על אותו אתר הכרה בדנא. מה שיקבע מי ינצח הוא האפיניות של האקטיבטור ושל המעכב, וריכוזם. (תמונה 3) עיכוב על ידי אינטראקציה בין פקטור מאקטב לפקטור מעכב - האקטיבטור והמעכב נמצאים באתרי הכרה שונים על הדנא. לרפרסור יש אתר קישור לאתר הפעיל של האקטיבטור. כאשר הרפרסור נקשר לאתר הפעיל הזה הוא מנטרל אותו ופוגע ביכולת ההיקשרות שלו לגתפ. (תמונה 4) עיכוב על ידי אינטראקציה עם פקטורי שעתוק כלליים - לרפרסור ולאקטיבטור יש אתר הכרה שונה לדנא. כשהאקטיבטור עובד, הוא לרוב נקשר אל פקטור השעתוק הכללי TF2D ומפעיל אותו.אם הרפרסור נקשר למקום זה, הוא מונע ממנו לתפקד. הרפרסור למעשה יודע לייצב את הקומפלקס על ידי היקשרות ל TF2D אבל הוא לא יודע לפתוח את הדנא ולכן הוא רפרסור (תמונה 5)

Question 12

מה הרעיון בלצמד בין אקטיבטור לרפרסור? לא לא פשוט לא ליצור אקטיבטור כשלא צריך וליצור אותו כשכן צריך?

Answer 12

חסכון בזמן. אם התא היה צריך ליצור אקטיבטורים זה היה לוקח לו הרבה זמן. כאשר יש גם מעכב וגם אקטיבטור, כל מה שצריך הוא מודיפיקציה כדי להגביר או להוריד שעתוק

Question 13

כידוע, הדנא מלא באיזורים דחוסים מלאי היסטונים שנקראים הטרוכרומטין. האם הרנא פולימרז יכול לגשת לאיזורים אלו? כיצד מתבצעת הנגישות?

Answer 13

הרנא פולימרז לא יכול לגשת לאיזורים דחוסים בדנא. ישנם פקטורי שעתוק שאחד התפקידים שלהם הוא לקחת כרומטין דחוס ולפתוח אותו כדי לאפשר גישה לפולימרז ולשאר החלבונים הרלוונטים. פקטורים כאלו נקראים chromatin remodelers הם יודעים לסלק לגמרי נוקלאוזומים מאיזורי הבקרה העיקריים כמו טאטא בוקס וכל איזור האסמבלי של הרנא פולימרז בתחילת השעתוק ולהותיר את הדנא עירום.

Question 14

כיצד התבצע הניסוי שהצביע על כך שהכרומטין סביב איזור המקודד לגן משתנה (בדחיסותו) בין תאים כתלול באם הם מבטאים את הגנים האלו?

Answer 14

לקחו שתי רקמות - באחד מהם הגן מושתק ובאחר הגן מתבטא. הכניסו DNAse ידוע שהדנאז מעדיף לחתוך דנא ללא חלבונים (היסטונים). עשו זאת מספר פעמים, כל פעם הוציאו את הדנאז אחרי כמות שונה של זמן. את הפרגמנטים שנוצרו הריצו על ג’ל. מה שגילו זה שבמקומות בהם הדנא לא התבטא (איזורים דחוסים) הדנאז בקושי הצליח לעבוד, בעוד באיזורים בהם הדנא התבטא הוא הצליח לעבוד יפה מאוד.

Question 15

כיצד נקרא האתר בו DNAse מבצע חיתוך?

Answer 15

hypersensitive site

Question 16

מה זה

two hybrid system?

איך נדע אם חלבון מסויים נקשר לחלבון אחר?

Answer 16

Question 17

מהי ספריה גנומית?

Answer 17

אוסף הדנא הגנומי הכולל של אורגניזם בודד אשר מאוחסן בפלסמידים המכילים את מקטעי הגנום

Question 18

באופן כללי, ולא מאוד ספציפי, איך בונים ספריה גנומית?

Answer 18

1. ממצים את הדנא מהאורגניזם
2. מקצצים את הדנא לקטעים קצרים בהתאם לצרכינו
3. מחדירים את המקטעים לפלסמידים של חיידקים. מכלול הפסמידיםעם הדנא נקרא ספרייה גנומית. יש לדאוג שלחיידק (אי קולי) תהיה עמידות לאנטיביוטיקה (שהכנסנו עם הפלסמיד) על מנת שנוכל להשמיד את כל החיידקים הלא רלוונטים.
4. כל חיידק מהווה מקור למושבת חיידקים. כך בעצם נשכפל את הפלסמידים שהכנסנו

Question 19

איך מודדים את מורכבות הספריה הגנומית?

Answer 19

מורכבות הסיפרייה הגנומית אומרת עד כמה ערימת הפלסמידים שיצרנו מייצגת את הגנום שהתחלנו ממנו. אנו רוצים ספריה עם רמת מורכבות גבוהה שמייצגת את מורכבות הגנום שהכנסנו לספרייה.

Question 20

האם כאשר בונים ספרייה גנומית כל גן מיוצג בהתאם לכמותו היחסית בגנום?

Answer 20

כן

Question 21

מהי ספריית

cDNA

ומהו מקורה? האם היא מתייחסת לגנום של כל האדם?

Answer 21

זו סיפרייה שמקורה ב

mRNA

המופק מרקמה כלשהי באורגניזם. היא מייצגת רק את החלבונים ברקמה מסויימת

Question 22

מהם השלבים ליצירת ספריית

cDNA?

Answer 22

Question 23

מה המטרה של יצירת ספריית

cDNA?

Answer 23

המטרה היא לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון

Question 24

מה הבעיה במסגרת הקריאה ביצירת ספריית

cDNA?

Answer 24

האנזים

reverse transcriptase

עוצר רנדומלית במהלך השעתוק מרנא לדנא. אם הוא יעצוק באמצע של קודון יהיה פריימשיפט. לכן למעשה רק שליש מהסיפרייה מבטא חלבון אמיתי

Question 25

אם לא נקפיד על הכיווניות בעת הכנת ספריית

cDNA

כמה אחוזים מהסיפרייה שלנו יבטאו חלבון אמיתי?

Answer 25

גם ככה יש את הבעיה עם הפריימשיפט שמורידה אותנו לשליש. אם לא נקפיד על כיווניות זה יגיע לשישית (חצי מזה)

Question 26

מבחינת המורכבות של סיפריית ה

cDNA

פי כמה נרצה אותה מכמות החלבונים שיש בפועל

Answer 26

פי 3 כי גם ככה בגלל הפריימשיפט רק שליש מבוטאים.

Question 27

האם ביצירת סיפריית

cDNA

תמיד נרצה לקבל חלבונים באורך מלא?

איך נקצר את החלבונים?

Answer 27

לא. אנחנו רוצים לבדוק אינטראקציות עם חלבונים אחרים ולכן לפעמים נעדיף לקבל מקטעים קטנים של החלבונים, אם אלו יודעים להקשר אחד עם השני.

על מנת לקצר את החלבונים נשתמש בפריימר רנדומלי שיכול להתחבר על כל מקום בגן

Question 28

כמה גנים יש בשמר?

Answer 28

6000

Question 29

לאחר שבנינו ספריית

cDNA

לשמר. איך נבדוק אינטראקציות בין חלבונים?

Answer 29

לוקחים חלבון מסויים עם

DBD-DNA binding protein

ומפגישים אותו עם כל 6000 הגנים שיש להם

AD-Activation domain

עושים את זה לכל החלבונים ורואים מי בא באינטראקציה עם מי. כלומר מי מהם יגרום לשעתוק דנא

Question 30

מה הבעיה עם שיטת סיפריית

cDNA

לבדיקת אינטראקציות בין גנים

Answer 30

יש הרבה דוגמאות בסיכום, אבל בגדול הבעיה היא שהתנאים בהם יבדקו את החלבונים הם לא בהכרח התנאים בתא. לכן, יכולות להיות אינטראקציות בין חלבונים שסתם ככה לא היו נפגשים. או שמפגש שאמור היה לקרות בתא לא יקרה כי אחד החלבונים למשל לא עבר פוספורילציה וכ’ו

Question 31

ערוך השוואה בין ספרייה גנומית לספריית

cDNA

באספקטים הבאים:

הרכבת, גודל, מורכבות, ביטוי הגנים, וחסרון

Answer 31