הרצאה 6

Question 1

מהי מוטגנזה?

Answer 1

טכניקה במחקרים ביולוגיים בה יוצרים מוטציה באתר מוגדר מראש בדנא. על מנת לבצע זאת עלינו לדעת מראש מה הגן התקין ובהתאם אליו יוצרים גדיל שנושא מוטציה. לאחר מכן מחדירים את הגן עם המוטציה לתא חי על מנת שיתבטא חלבון מוטנטי. ככה אפשר ללמוד על פעולתו של החלבון

Question 2

מה משמעות המושג

forward genetic screens?

Answer 2

כאשר ידוע הפנוטיפ ומחפשים את הגן שגורם לו

Question 3

מהי השיטה

screening?

Answer 3

זו שיטת ביצוע של

Forward geneetic screens

בה עושים מוטגנזה אקראית בתאים ובודקים מה הפנוטיפ של המוטציה

Question 4

מה משמעות המושג

reverse genetic screens?

Answer 4

ידוע גן כלשהו בודקים לאיזה פנוטיפ הוא גורם

Question 5

מה זה

loss of function

מה זה

gain of function

Answer 5

loss of function

אינאקטיבציה של גן, אובדן ביטוי חלבוני

gain of function

ביטוי של גן יתר על המידה. יצירת יותר פעילות חלבונית של הגן בתא

Question 6

מהי שיטת רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע?

מה המטרה של השיטה?

מתי היו משתמשים בה? מה ניתן לומר על היעילות שלה?

Answer 6

המטרה הייתה לשנות גן של ייצור, למשל עכבר, כך שיבטא גן שמעניין אותנו לבדוק.

השתמש בה בעבר, היא מאוד לא יעילה.

הרעיון הכללי הוא לקחת דנא שהונדס גנטית ולנסות לגרום לרקומבינציה בינו לבין דנא של עכבר, כך שהוא יבטא את הגן שמעניין אותנו

Question 7

תאר את המנגנון של ביצוע

homologous recombination

בעכברים

Answer 7

Question 8

מהי שיטת

Neo

מה מטרתה?

איך עושים אותה?

Answer 8

זוהי שיטה שהשתמשו בה בעבר להכנסה של גן רצוי לעכברים (על מנת לחקור). מבוססת על ניסיון ליצור רקומבינציה

Question 9

ידוע שמנגנון

NHEJ

הוא מנגנון תיקון בעייתי שמתרחש בו איבוד מידע. איך ניתן להשתמש בעובדה זו לטובתנו במחקר?

Answer 9

אם נרצה לצורך מחקר לפגוע בגן מסויים, נוכל לחתוך באמצע הגן הזה באמצעות אנדונוקלאז, ואז לקוות שמנגנון התיקון שיעבוד יהיה

NHEJ

ושהוא יפגע ביכולות הגן.

פגיעה בפעילות הגן נקראת “נוק אאוט” לגן

Question 10

איך נוכל להשתמש בשיטת התיקון

HDR-mediated repair (homologous recombination)

לטובתנו, לצורך מחקר?

Answer 10

נוכל לחתוך את הדנא איפה שנרצה, להביא לפעולה של מערכת התיקון

HDR-mediated repair

ובדיוק כשהיא צריכה לעבוד נכניס את מקטע הדנא שאנו רוצים להכניס לדנא, ונקווה שמערכת התיקון תכניס אותו פנימה.

כך אפשר לעשות נוק אין לגן, כלומר להכניס גן שמעניין אותנו

Question 11

יש שתי שיטות שאנו מכירים לתיקון שבר דו גדילי

NHEJ

HDR-mediated repair

למה כל אחד מהן משמשת?

נוק אין? נוק אאוט?

Answer 11

NHEJ

נוק אאוט

HDR-mediated

נוק אין

Question 12

מה שמם של שני האנדונוקלאזות בהם משתמשים כיום על מנת לחתוך את הדנא במקום רצוי?

Answer 12

TALEN

CRISPER

Question 13

איך חלבון

TALEN

בנוי? איך הוא יודע לאן להקשר?

Answer 13

החלבון בנוי מ18 רצפים חוזרים, מעט שונים. באמצע של כל רצף יש שתי חומצות אמיניות, שיודעות להקשר לבסיס מסויים בדנא

HD-C

HN-G

NG-T

NI-A

בטאלן שנהנדס, נכניס 18 רצפים, שבמרכז שלהם יש שתי חומצות אמיניות בהתאם לבסיסים שאנחנו רוצים לתפוס. ככה נהיה ספציפיים לרמה ייחודית של רצף של 18 בסיסים.

Question 14

איך החלבון

TALEN

מבצע את החיתוך?

איך נקרא החלבון שעושה את החיתוך הזה?

Answer 14

הוא עובד כדימר. צריך שייקשר גם לגדיל העליון וגם לגדיל התחתון. בקצה של הטאלן יש חלבון בשם

FOK1

כאשר פוק1 שנמצא על הגדיל העליון נפגש עם פוק1 שנמצא בגדיל התחתון הם מבצעים את החיתוך. ראה תמונה

Question 15

מהו איזור הקריספר בדנא של חיידק?

Answer 15

מדובר במעין ספריה של קטעי דנא נגיפי, של בקטריופאג’ים.

Question 16

מהו החלבון

Cas9?

איפה הוא נמצא בדנא?

Answer 16

זהו חלבון שמשמש כנוקלאז (יותר נכון, הוא חלק מקומפלקס של חלבונים שמשמשים יחד כנוקלאז). הוא נמצא בסמוך לאיזור הקריספר (איזור שהוא בעצם סיפרייה של דנא נגיפי)

Question 17

מה מיוחד בחלבון

cas9

מהן שתי התכונות שלו?

Answer 17

מה שמיוחד הוא שהוא גם הליקאז וגם נוקלאז

Question 18

מהו

trcr RNA (tracer RNA)z?

Answer 18

זהו רצף רנא שצריך להתחבר לקומפלקס החלבוני של

cas9-crisper RNA

על מנת להפעיל את מנגנון החיתוך

Question 19

מהו

PAM?

(מנגנון קריספר)

Answer 19

רצף של שלושה נוקלאוטידים בו חותך המנגנון קריספר

Question 20

תאר את מנגנון הפעולה של מנגנון קריספר של חיידקים, לפירוק בקטריופאג’ים שתוקפים אותם

Answer 20

Question 21

איך אפשר להשתמש במנגנון קריספר במחקר?

Answer 21

מייצרים רנא שיוכל להתחבר לדנא שמעניין אותנו, מחברים אליו

Cas9

ולאחר מכן או להשתמש בהחדרת דנא ונוק אין דרך שיטת

HDR

או להשתמש ב

NHEJ

כדי לעשות נוק אאוט