OXPHOS - Síntese ATP Flashcards
Mecanismo de síntese do ATP
energia livre do gradiente electroquímico protónico formado através da membrana interna mit –> utilizada na síntese de ATP pelo ATP sintase (= ATPase bombeador de protões = F1Fo-ATPase.)
estudos sobre o ATP sintase anos 60, Efraim Racker
Partículas submitocondriais
cadeia respiratória = rel. inacessível a manipulação experimental em mits intactos. MAS se os mis rompidos por sonicação –> partículas submitocondriais = cristas quebradas que se voltaram a fechar em pequenas vesículas fechadas ~ 100 nm de diâmetro
microscópio electrónico–> superfícies externas cobertas com pequenas esferas ligadas às membranas por hastes => tipo chupa-chupa (cogumelo)
mits intactos: lado interno (matriz) da membrana interna
==> partículas submits = vesículas invertidas da membrana interna do mit! –> são facilmente providas com os metabolitos aos quais a membrana é impermeável e que estariam em condicões normais na matriz
+NADH, ADP e Pi, partículas submits transportam e- desde o NADH até ao O2 e acoplam esta oxidação à síntese de ATP, catalisando a reacção ADP + Pi –> ATP.
Estrutura do ATP sintase
Efraim Racker:
ATP sintase tem 2 unidades funcionais = Fatores de acoplamento:
F1 - Proteína solúvel com atividade de ATPase mas não de ATP sintase
Fo - Proteína ligada à membrana e sensível à oligomicina
F1 + Fo - atividade de ATP sintase (sensível à oligomicina)
Partículas submits das quais o F1 foi removido com ureia: SEM chupa-chupas na microscopia electrónica e SEM capacidade de sintetizar ATP!!
=> chupa-chupas = F1 ligados ao Fo por haste/eixo ~ de 50 A
!! Hydrophobic F0 domain sits in the membrane - performs proton translocation
vs. Hydrophillic F1 portion protrudes from membrane - performs ATP synthesis/ hydrolysis
Estrutura detalhada ATP
Anos 90 (1º e.coli) [VER ESQUEMAS}
E. Coli:
F1 –> 3alpha : 3beta : gamma : epsilon
F0 –> a : 2b : delta : 10c (!DCCD inibe aqui no c)
(cabeça chupa: alpha, beta)
F1 e F0 ligadas por 2 eixos /hastes: Um central (com subs gama e epsilon) e outro lateral (subs delta e b)
Mits:
Nos mamíferos, subs adicionais presentes sobretudo nas hastes/eixos, ainda objeto de discussão:
e, f, g, A6L = subs minoritárias, situadas na membrana
F1 –> 3alpha : 3beta : gamma : delta : epsilon
F0 –> a : 2b : 8c : OSCP
:F6 : d: e : f : g : A6L : DAPIT : 6,8 kDa
(OSCP = Oligomycin-sensitiity conferring protein; F6 = Coupling factor 6; DAPIT = diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue )
Oligomicina: liga-se por uma ligação de H ao resíduo de Glu59, essencial para a translocação de H+
DCCD: liga-se a carboxilato na subunidade c a baixas [] e a altas [] inibe também nas subunidades beta
ESCLaRECER?! Síntese ATP: direção ponteiros do relógio? rotação de g vista como contrária aos ponteiros do relógio a partir da matriz
Mecanismo de ação do ATP sintase
1974, Racker, Stoeckenius:
bomba proteica propulsionada pela luz (bacteriorodopsina da Halobacterium halobium) em lipossomas com ATP Sintase de coração bovino:
quando iluminados–> síntese ATP ==> ATP sintase não tem de estar lig diretamente aos complexos cad resp + força motriz protónica pode ser gerada num sítio e usada noutro
- Translocação H+ efetuada pelo Fo
- Catálise da formação da lig fosfoanidrido do ATP efetuada pelo F1
- Acoplamento da dissipação do gradiente protónico com a síntese de ATP, requer interação de F1 e Fo
Estrutura do F1
John Walker (tmb serviu como confirmação mecanismo ATP sintase Paul Boyer)
5 subs diferentes, estequiometria alpha3-beta3-gamma-delta-epsilon
Arranjo hexagonal alternado subs maiores alpha e beta; com 2 hélices alpha enroladas na sub gamma no centro
gamma tem loop dobrado da hélice que constitui “haste” dentro do anel de unidades alpha e beta que se alternam. !!!subunidade gamma é assimétrica
!bovine delta subunit (may have role in binding the shaft to the ring of c subunits in Fo) = epsilon subunit of bacterial F1
Abrahams et al. (1994)
F1 fcristalizada na presença de ADP e de AMP-PNP (trifosfato de adenosina-5’-(beta,gamma-imido)–> análogo não hidrolizável do ATP)
Subunidades alpha:
3 ligadas ao AMP-PNP
!None of the alpha-subunits opens in a similar way. All remain closed, each binding a Mg2+ ion and a nucleotide + they remain bound throughout the catalytic cycle. The nucleotides bound to α-subunits have no known direct role in the formation of ATP.
Subunidades beta:
1 ligada ao ADP (betaDP)
1 ligada ao AMP-PNP (betaTP)
1 sem ligações (betaE, empty)
–> 3 centros catalíticos nas subs beta!
Síntese do ATP em F1
Mecanismo da mudança de ligação (Boyer, 1983)
F1 tem 3 protómeros catalíticos, cada um num estado conformacional diferente:
- um que liga fracamente substratos e produtos (estado L, Loose); ADP+ P ligam aqui
- um que liga fortemente S & P (estado T, Tight), lig fosfoanidro do ATP sintetizada só aqui
- um que não liga S nem P (estado O, Open); ATP liberto só aqui
energia livre da translocação de H+ (e não transferência de e-, como formulação original acoplamento conformacional) –> mudanças conformacionais no ATP sintase que propulsionam a formação de ATP
Ideia radical: F1Fo - ATP sintase = motor rotativo bio
Questões que surgem…
- Como é que as mudanças conformacionais são propagadas nos três locais catalíticos em F1?
- Como é que a catálise em F1 está acoplada à translocação de protões?
- Boyer (1983): ambas ocorrem pela rotação de uma ou mais das unidades contendo uma única cópia presentes em F1
(We now know that it is the gamma and epsilon subunits that provide the rotor)
Cox et al. (1984): o anel com a subunidade c roda em relação às subunidades a e b durante a translocação de H+
Mudanças de ligação em F1
propulsionadas pela rotação da subunidade gamma:
Ao fim de cada 120º de rotação da subunidade gammas –> libertação de 1 molécula de ATP
Por cada 360º de rotação cada subunidade beta passa pelos 3 estados (betaL, betaT e betaO) + sintetizadas 3 moléculas de ATP
Direção da rotação de gamma: contrária aos ponteiros do relógio quando há hidrólise do ATP e o inverso quando há síntese (vista a partir de Fo)!!!
Quando há hidrólise do ATP assume-se que ordem das mudanças conformacionais é invertida (betaO, betaT e betaL)
visualização rotação
1997, Noji et al
filamento fluorescente de actina à subunidade gamma (marcador) --> observar movimento directamente com câmara de video ligada a um microscópio. Com ATP (em condições de hidrólise) o filamento teve mov. rotacional de + 100 rotações na direcção contrária à dos ponteiros do relógio quando vista do lado de Fo (de baixo)
Actina viscosa –> rotação lenta, só 3% vel turnover
=> hoje: partículas de ouro (40nm)
Kinosita, Yoshida et al
134 revoluções/s –> rate expected at steady-state ATP hydrolysis under the conditions used (23°C, 2 mM ATP)!
+ able to dissect out two substeps in the rotation of gamma between two alphabeta pairs, separated by short time: ∼90° (ATP binding) and ∼30° (they argue it occurs with product release) => 120° overall rotation for each ATP hydrolyzed or synthesized
[Pänke, O. et al. (2000): strep-tag sequence into the C-terminal end of subunit c –> (a) purify the holoenzyme and (b) monospecifically attach a fluorescent actin filament to subunit c; EFoEF1 immobilized on a Ni-NTA-coated glass slide by the engineered His-tag at the N-terminus of subunit L; with MgATP –> rotations]
PN Química 1997
1/2: Paul Boyer, John Walker
“for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of ATP”
1/2 Jens C. Skou, “for the first discovery of an ion- transporting enzyme, Na + , K + -ATPase”
–> maintains the balance of sodium and potassium ions in the living cell
Rotor e Estator do Motor
Capaldi 2002
Estudos com crosslinking (1º induzidos por reagentes químicos modificadores, dps incorporação genética de pares de resíduos de cys em partes do complexo)
–> gamma, epsilon e o anel das subs c podem ser ligadas entre elas cov sem perda do bombeamento de H+ devido à atividade de Atpase nem da síntese de ATP –> devem rodar em conjunto
–> delta lig cov a alpha sem ser afetada atividade ATPase/ bombeamento H+
Fillingame et al: anel da sub c roda contra parte ab2; Cross et al: dependência do anel c rel a a
rotor - gamma-epsilon-cn estator – alpha3-beta3-delta-a-b2
!Flexibilidade do estator importante!!
Em suma: mec rotação ATP sintase
2 motores rotativos F1 and Fo ligados entre si
O fluxo de H+ através do motor Fo –> rotação do anel do rotor formado pelas subunidades c
O anel c liga-se à subunidade gamma. A rotação de gamma –> mudanças conformacionais nos locais de ligação catalítica aos nucleótidos nas 3 subunidades beta do motor F1 => síntese e libertação de ATP.
MAS só se as partes que não rodam (estáticas de ambos os motores) estão fixas umas às outras para impedir a co-rotação do anel alpha3-beta3 com a subunidade gamma. –> haste que serve de estator
Como é que os protões levam à rotação do anel c ? Mecanismo de rotação do rotor Fo
Estudos mutagénese…
–> modelo de 2 semi-canais: cada subunidade c protonada no resíduo de Asp61 (E. coli) ou Glu59 (bovina) com um H+ vindo pelo semi-canal quando este monómero entra em contacto com a subunidade a
- subunidade c protonada roda 360° antes de libertar um H+ através do segundo semi-canal e entra em contacto novamente com um resíduo de Arg na subunidade a.
- (Arg+Glu-) não há rotação, (Arg+ GluH) há rotação.
=> rotação das hélices de c e a uma à outra = geradora da rotação do anel c!
=> Subunidade a:
estrutura ainda não observada diretamente…
se ATP sintase:
H+ entra no semi-canal citosólico; sai no semi-canal da matriz
(ATPase ao contrário)
[Dimroth et al (enzima de Propionigenium modestum)
F1F0 pode bombear Na+ e H+ facilitando os estudos de lig do ião a ser translocado enquanto enzima está ativo]
Estruturas dos anéis c de ATP sintases de diversas espécies/ Custo bioenergético SÓ do funcionamento do ATP sintase
Mamíferos: 8 H+/3 ATP ou 2,7 H+/ATP
Fungos: 10 H+/3 ATP ou 3,3 H+/ATP
Bactérias: 11 H+/3 ATP ou 13H+/3 ATP, 3,7-4,3 H+/ATP
Cloroplastos: 14 H+/3 ATP ou 5,0 H+/ATP.
