Complexos da cadeia de transporte el. mt. Flashcards
Complexos Cadeia
Isolamento de fragmentos da cadeia (detergentes como desoxicolato/colato a baixas T e [] –> rebentar ints líp-prot mas não prot-prot)–> fracionamento em 4 complexos (Youssef Hatefi, David Green):
Complexo I/ NADH-ubiquinona oxidoredutase (1)
Complexo II/ Succinato DH/ succinato-ubiquinona oxidoredutase (2)
Complexo III/ complexo dos cyts bc1/ ubiquinol-cyt c oxidoredutase (3)
Complexo IV/ cyt c oxidase (7)
Complexo V/ ATP sintase
(~20 transportadores discretos, mas só Q (50) e cyt c (9) funcionam independentemente! Outros: complexos multiproteicos)
!! complexos isolados podem ser combinados com fosfolípidos e um detergente –> reconstituir a cadeia respiratória! Quando detergente é removido (diluição/ diálise), fosfolípidos juntam-se em vesículas e proteínas são incorporadas na bicamada lipídica
Modelo fluido/ colisões aleatórias
Hackenbrook, 1977
Cada complexo= diversos componentes proteicos associados com grupos prostéticos passíveis de alterações redox.
Dentro de complexo individual, transportadores de e- em razão molar fixa, mas difs complexos em quantidades não equimolares!
!!!complexos I a IV difundem-se lateralmente na membrana ligados por transportadores de e- que difundem livremente (Q e cyt c); transferência de e- baseada em colisões aleatórias dos complexos individuais
Cinética de transferência de electrões na mistura –> complexos não se ligam directamente uns aos outros! O movimento de e- de complexo I até Complexo III mediado pela difusão de UQH2 dentro da bicamada lipídica e do Complexo III até ao cyt c oxidase pela difusão do cyt c reduzido ao longo da superfície da bicamada (solúvel em água, ligado fracamente à membrana por ints electrostát rel. fracas)
!Último passo (transf O2) não é reversível
Complexo I
ox NADH + red Q
reagentes: 4H+ (N) –> negative, lado da matriz da MMI
produtos: 4H+ (P) –> positive, lado do espaço intermembranar da MMI
deltaG para tradução energia (síntese ATP)…= transdutor de energia
Muito complicado, >43 polipéptidos, forma “tornozelo” c/ parte que sai da membrana (–> difs hidrofobicidades)
Zona hidrófoba: translocação H+; zona hidrófila (braço): red NADH/NAD+
14 subunidades, ligado a 9 centros redOX: 8 Fe-S e 1 FMN
[defeitos –> ajudam a ter Parkinson’s?]
PASSOS REAÇÂO:
! Provável reação entre NADH e FMN ser transf de H- (evitar radical intermed de NADH)
Dps FMNH- reoxidado em 2 passos de 1 e- (aceitador primário de e-: Fe-S N3, reage magneticamente com radical semiquinona de flavina; dps N2, reage magneticamente com semiquinona ligada)
Transf de e- de FMNH- à Q
Complexo II
Principal Componente: Succinato DH
–> transf de e- para Q!
!deltaG neg mas peq–> não é transdutor de energia
bastante simples 4 polipéptidos, Fp c/ FAD; Ip c/ 3 centros Fe-S; CybL c/ cyt b mas pode não fazer parte? (âncora para Fp); CybS (âncora para Ip)
Complexo III
(Hatefi 1961, de mit de coração bovino)
=QH2-citocromo c oxidoredutase
QH2 + 2 citocromo c (Fe3+) + 2H+(N) –> Q + 2 citocromo c (Fe2+) + 4H+(P)
deltaG0’= - 36,7 kJ mol-1
–> transdutor de energia!
-homodímero de 11 difs polipéptidos cada: 3 associados a centros redox:
-cyt b com 2 grupos hemo (low, aceitador de e- da semiquinona, & high potential, dador de e- à ubiquinona)
-cyt c (hemo c aceitador de e- do ubiquinol; solúvel em água, conformação semelhante à protein de Rieske, mas ancorado pelo C-terminal)
centro Fe-S –> proteína de Rieske! (centro [2Fe-2S] aceitador de e- do ubiquinol; ligado ao polipéptido por quelação de um dos ferros com 2 resíduos de cya e 2 resíduos de his, pouco usual)
[provável: estrutura globular incorporando o centro [2Fe-2S] e extendendo-se para a camada aquosa para lá da bicamada lipídica no lado citosólico da membrana estando ancorada à membrana através do lado N-terminal hidrófobo]
2 centros redox (2 cyt do tipo b) em lados opostos da membrana.
A presença de deltapsi faz oposição a esta transferência e- de P para N diminuindo o valor de deltaG mas facilita transferência de 1 e- de N para P! Com potencial de membrana e- fluem para citocromo bL (lado P da membrana) –> torna igual o grau de redução dos dois cyt e a alteração aparente do potencial de meio ponto de bH
Ciclo Q (motor de H+)
explica modo como e- são transferidos no complexo III
(Wikstrom+Berden –> ciclo b; Mitchell, 72 –> ciclo Q; com modifs de Slater –> Ciclo Q duplo)
QH2 –> (bL, bH) –> ISP –> c1 –> c
Não transferência linear de e-! Pq: redução do cyt b induzida por oxidantes! (oxidação do cyt c deveria levar a oxidação cyt b; mas há red! Amplificada por antimicina (que bloqueia transf. de e- na região dos cyt b))
[Ox cyt c –> ox sequencial do cyt c1 e da ISP. ISP oxida o QH2, gera redutor Q.-(citosol) para o citocromo b. + velocidade de ox do cyt c –> aumento transiente na redução do cyt b (+ velocidade de formação de Q.-)
Antimicina inibe a red da Q e da Q.- pelo cyt bH. Formação rápida de Q.- provocada pela ox do cyt c, cyt c1 e ISP –> transferencia e- para os cyt bL e bH onde ficam “presos” c/ antimicina. (Sem antimicina, a red dos cyt b induzida por oxidantes é transiente –> depois cyt b reoxidado pelo UQH2 e pela Q.- do lado da matriz)]
–> o UQH2 é oxidado quer pelo cyt c1 quer pelo cyt b!!
Ciclo Q - fase 1
Oxidação do QH2 no local Qp!
Pool Q, QH2 na membrana mit interna em grande excesso molar
(Em,7 QH2 /Q = + 60 mV
Eh,7 QH2/Q = 0 mV)
Mol. de Q2 da pool –> local Qp (adjacente prot Rieske, face P membrana) –> oxidação em 2 fases:
- e- transferido do QH2 para prot. de Rieske (–>cyt c1…) –> liberta 2 H+ para espaço intermembranar, fica radical semiquinona Q.- em Qp
(Em,7 QH2 /Q•– = + 280 mV, semelhante ao da prot. Rieske; como mto maior que Em,7 da ox com 2 e- –> 2ª fase energéticamente favorável pq semiquinona quer perder o 2º e-
–> Em,7 Q•– /Q = - 160 mV)
- e- transferido para o hemo bL (também perto face P)
Ciclo Q - fase 1, pt.2
Redução do Q.- no local Qn
e- em bL –> bH
(Em,7 bL = - 100 mV
Em,7 bH = + 50 mV; !pots medidos sem delta psi! se for ~170 mV –> opõe-se à transferência de e- de bL para bH –> e- retêm a energia original ao passar de bL para bH (queda para potencial redox mais pos compensado pela transferência desfavorável de um e- com carga neg do lado P para o lado N) –> potenciais de membrana muito altos retardarão a transferência de e- entre os 2 hemes tipo b —> prolongamento da ocupação do local Qp pela semiquinona + aumentando P(produção de superóxido)
O QH2 e Q podem migrar sempre livremente de um lado para o outro da zona hidrófoba (não possuem carga!) . Um 2º local de ligação Qn na vizinhança de bH liga-se ao QH2 –> transferência do e- do bH reduzido formando-se semiquinona.
À 1ª vista isto pode parecer TD pouco provável uma vez que Em,7 para o par Q.-/Q em solução é -160mV, enquanto que o do bH é +50 mV. MAS: se Qn se ligasse à semiquinona muito + fortemente que a Q –> deslocar Em,7 para um valor mais pos = tornando Q + facilmente reduzível. (diferença de 10 vezes na ligação à semiquinona relativamente à Q –> Em,7 fica 60 mV + pos. Diferença de 300 vezes na ligação da semiquinona –> Em,7 fica 150 mV mais positivo.)
=> não se aldrabou a 1ª lei da TD (energia necessária para a adição de 1 2º e- para gerar QH2 é aumentado prop., i.é o Em para o par QH2livre/Q.- ligado é tornado prop. + neg)
Ciclo Q - fase 2
redução do Q.- em Qp
Semiquinona ligada firmemente ao local Qp.
2ª mol de QH2 é oxidada em Qp repetindo-se o a fase em que há passagem de 1 e- para o cit c1 e outro para bH via bL. –> este 2º e- compete com a redução de Q.- em QH2 (os dois H+ necessários vêm da matriz) QH2 volta para a pool –> finalizando o ciclo!
Ciclo Q - 3 pontos importantes!
- Há 2 vias para a red do cyt b:
- pela Qp.- (do lado citosólico), via favorecida TD e que opera em conds catalíticas
- pelo QH2 ou Qn.- (por inversão das reacções 7 e 8 caso a via TD favorecida esteja bloqueada) em condições de pré-estado estacionário
[Existência das 2 vias confirmada usando experiências em que se removeu a ISP do complexo e testando os efeitos da inibição com antimicina na red dos cyt b e c1 com e sem ISP:
- remoção ISP –> bloqueio red cyt c1 mas não do cyt b (via alternativa)
- adição antimicina –> a remoção da ISP bloqueava a red de ambos os cyt b e c1.
- Reconstituição do complexo por adição da ISP –> restaurava red dos cyt c1 e b que tinha sido bloqueada pela antimicina.
- Ox do QH2 e a red da Q em 2 locais separados (Qp, Qn). (topograficamente dispostos na direcção dos lados pos (citosólico) e neg (matriz) da membrana) –> Qp.- e Qn.- diferem nas suas props TD!
- ciclo Q explica a estequiometria de translocação de H+ através da membrana.
[myxothiazole bloqueia os eventos em Qp]
Complexo III transfere 2e- do QH2 para 2 mols de cyt c, deposita 2 H+ do QH2 no espaço intermembranar e transloca 2 H+ adicionais da matriz para o espaço intermembranar por par de e- ransferido. –> dos 4 H+ transferidos para o espaço intermembranar, 2 são escalares e 2 são vectoriais.
–> Ciclo Q completo: 2 mols de QH2 oxidadas a ubiquinonas, mas 1 das mols de ubiquinona é novamente red a ubiquinol. A proteína de Fe-S, o cyt c1 e os dois hemes do cyt b são 2x reduzidos e reoxidados.
2ª parte do ciclo, o heme do cyt b reduz a ubisemiquinona (formada na 1ª parte do ciclo), a QH2 consumindo 2 H+ do lado da matriz
Ciclo Q em reações
QH2 + cit c (Fe3+) –> Q.- + cit c (Fe2+) + 2 H+ (citosol)
QH2 + Q.- + cit.c (Fe3+) + 2H+ (matriz) –> Q + QH2 + cit.c (Fe2+) + 2H+ (citosol)
=> QH2 + 2cit c (Fe3+) + 2H+ (matriz) –> Q + 2cit c (Fe2+) + 4H+ (citosol)
Citocromo c
-peq prot globular solúvel em água
-extremamente básica (pI 10)
com res de lys que ajudam nas ligs eletrostáticas as complexos (III e IV) e membrana mit interna
-liga-se fortemente à cardiolipina–> âncora à membrana (eletrostáticas e hidrófobas) [regulação da ligação… mais tight –> maior atividade peroxidase, mto seletiva para CL com ácidos gordos poliinsat.]
+é fator pro-apoptótico! libertação para citosol –> “switch”
Cyt c –> apoptose…
Condições normais, o cyt c liga a cardiolipina por interações eletrostáticas soltas.
Com peróxido de hidrogênio ( formado por e- doados ao O2 pelo cyt c) –> interação mais forte –> desdobra parcialmente o cyt c –> converte-o num peroxidase com cardiolipina como substrato.
CL oxidada: baixa afinidade pelo cyt c –> este torna-se solúvel no espaço intermembranar.
Os lípidos da membrana mitocondrial são reorganizados durante a apoptose. A CL oxidada aparece na MMExt (–>permeabilização) –> atrai proteína pro-apoptótica tBID –> facilita a libertação do cyt c e outras proteínas apoptóticas do espaço intermembranar mitocondrial
Célula: possível gerar ROS proapoptóticos em resposta a sinais de stress específicos
Complexo IV
2 cit.c 2+ + ½ O2 + 2H+(N) + 2H+(N) –> 2 cit.c 3+ + H2O + 2 H+(P)
Faz transdução de energia (–> síntese ATP)
- proteína transmembranar, 13 unidades (coração bovino)
- unidades + hidrófobas (I, II e III) são codificadas pelo DNA mitocondrial (Calhoun et al., 1994) + formam provavelmente hélices que atravessam a membrana como acontece com o citocromo b
- complexo IV existe como um dímero.
- Subunidades I e II contém os 4 centros redox: 2 cyt a e 2 átomos de Cu (CuA e CuB) –> principais funções (transportar H+ para fazer água e garantir que há bombeamento dos H+)
Subunidade I–> centro binuclear hemo-cobre (2 hemos e CuB), também responsável pelos canais para bombeamento… também local de coordenação no Fe do hemo–> local de lig para ligs exógenos (CO, CN)
Subunidade II–> doação de e-
a subunidade COX4 liga-se ao ATP –> inibição alosterea da actividade do COX para razões ATP/ADP elevadas–> COX4 tem um papel regulador
transferência e-: lig eletrostat do cyt c à subunidade II –> transf el. do centro CuA para hemo a
Mecanismo de redução do dioxigénio a água
(no cyt c oxidase)
Marten Wikstrom, Gerald Babcock
4 transferências unieletrónicas:
- Formação de intermed. dxi [ligação de O2 a cyt a3, em que Fe(2+); cu b(1+) ligado a His e Tyr)]
- Formação da espécie P
[O-O quebra-se
