Introdução à OXPHOS Flashcards
Fosforilação oxidativa
delta Eº’= Eº’O2/H2O- Eº’NADH/NAD+= + 0,82 V –(-0,32 V) = 1,14 V
deltaGº’= - n F deltaEº’
–>deltaGº’= -2 x (96,5 kJ V-1 mol-1) x (1,14 V) = –220 kJ/mol
Herman Kalckar (1939): células aeróbias formam ATP a partir de ADP e Pi por um processo dependente da respiração
Eugene Kennedy & Albert Lehninger (1948):
Os mitocôndrios oxidam NADH e 2-3 ATP são sintetizados por NADH oxidado.
=> Acoplamento transporte el. com síntese ATP
Eficiência da fosforilação oxidativa
xADP + xPi + ½ O2 + NADH + H+ –> xATP + H2O + NAD+
Razão P/2e- : nº de moles de ATP formadas por par de e- transferidos ao longo da cadeia respiratória
==> RAZÃO P/O: Razão P/O = Nº de moles de ATP produzidos a partir do ADP por ÁTOMO de oxigénio reduzido pela cadeia respiratória!!
(Se os e- forem do succinato ou NADH até ao O2 : razão P/2e- = razão P/O)
–> Determinação da razão P/O: elétrodo de O2, para diferentes dadores de e- (1.beta-hidroxibutirato, 2. succinato, 3. ascorbato), na presença de mits num excesso de tampão de fosfatos (tmb com inibidores como 2. rotenona (CI) e 3. antimicina A (CIII))
–> 3 locais eventualmente acoplados à síntese de ATP
Controlo respiratório
A respiração e a síntese de ATP estão fortemente acopladas em mits intactos (“acoplados”);
Respiração é controlada pelas necessidades de síntese de ATP.
–> regulação da vel. de transporte el. pela disponibilidade em ADP
–> Razão entre vel consumo de O2 no estado 3 e 4 RC= v(ADP)/v(controlled)
Chance e Williams (1956)
Estado 1:
Mitocôndrios sozinhos (na presença de Pi).
Estado 2:
Adição de substrato, respiração baixa devido à falta de ADP
Estado 3:
Uma quantidade limitada de ADP é adicionada, permitindo uma respiração rápida
Estado 4:
Todo o ADP foi convertido em ATP e a respiração torna-se lenta
Estado 5:
Anoxia.
Desacopladores
O acoplamento entre a respiração e a síntese do ATP é perdido:
- Quando é perdida a integridade da membrana (ex se mits colocados numa solução hipotónica eles incham, e a vel respiração pode aumentar mesmo sem adicionar ADP. + há diminuição da razão P/O para zero! –> leakage (permeabilidade) de H+ através da membrana)
- Na presença de desacopladores (geralmente ácidos fracos lipófilos, dissociam facilmente 1 dos H+)
2,4- Dinitrofenol (DNP);
Carbonilcianida-p-trifluorometoxifenilhdrazona (FCCP);
Carbonilcianida-m-clorofenilhidrazona (CCCP)
+desacoplador –>
na presença de substrato oxidável o consumo de O2 aumenta bruscamente até todo o O2 se esgotar!! Mesmo sem adicionar ADP e Pi! Em mits leaky/ presença de desacoplador, energia livre libertada das reacções de transporte electrónico não é capturada para formar ATP! + Os desacopladores estimulam a actividade de ATPase nos mits! –> razão P/O =0 (não há síntese de ATP apesar do consumo de O2)
Inibidores do ATP sintase
- impedem o ADP de aumentar a velocidade de respiração
- Não bloqueiam o estímulo da respiração provocado por um desacoplador –> sugere: atuam diretamente no ATP sintase
Ex: Oligomicina, DCCD, venturicidina, aurovertina
Premissas
1- cadeia de transporte el. = seq. de transportadores de e- com 3 regiões distintas onde a energia redox pode ser conservada para a síntese de ATP
2- velocidade de respiração é controlada pelo ADP (controlo respiratório)
3- Acoplamento entre OXPHOS e transporte el. perdido quando membrana int perde integridade
4- Acoplamento entre respiração e síntese de ATP pode ser quebrado por “desacopladores” que acabam com o controle respiratório e estimulam atividade de ATPase
5- O antibiótico oligomicina inibe a síntese do ATP, hidrólise estimulada por desacopladores
6- Energia da respiração também pode ser acoplada (além da síntese de ATP) à acumulação de Ca2+ e à redução de NAD+ e NADP+
–> propulsionados através da hidrólise de ATP em mits em anaerobiose, sendo neste caso inibidos tanto por desacopladores como pela oligomicina. *
Since respiration and phosphorylation are in TD equilibrium, it should be possible for intact mit to reverse their direction of electron transfer at the expense of ATP hydrolysis. This was confirmed in 1060 by Chance and Klingenberg, It proceeds optimally at anaerobic conditions
Hipóteses de acoplamento energético
- Hipótese do acoplamento químico (Slater, 1953)
- Hipótese do acoplamento conformacional (Boyer, 1964)
- Hipótese do acoplamento quimiósmotico (Mitchell, 1961)
Hipótese do acoplamento químico (Slater, 1953)
essência do mecanismo de fosforilação ao nível do substrato!!! : substrato que sofre a oxidação é convertido num intermediário lábil (de “alta energia”) que posteriormente é degradado para formar ATP
ANALOGIA À GLICÓLISE:
1- GAP liga-se ao enzima GAPDH
2- O grupo SH do centro activo forma um tio-hemiacetal com o substrato
3 – O NAD+ oxida o tio-hemiacetal a um tioéster
4 - O NADH formado é substituído por um NAD+
5 – Pi ataca o tioéster formando um fosfato de acilo (1,3-BPG) e regenera-se o enzima activo
Hipótese do acoplamento químico (Slater, 1953) - Mecanismo
AH2 e B: componentes da cadeia de transporte eletrónico;
X e Y: fatores de acoplamento
Mecanismo de Acoplamento:
Passo 1 – transformação de energia da oxidação
AH2 + B + X -(eq)-> A~X + BH2
(A~X –> intermed de “alta energia”)
Passo 2 – transmissão de energia ao sistema de acoplamento
A~X + Y -(eq)-> X~Y + A
(X~Y intermed de “alta energia” sem componentes da cadeia resp)
Mecanismo de formação de ATP:
Passo 3 – transformação da energia
X~Y + Pi -(eq)-> X~Pi + Y
X~Pi + ADP -(eq)-> X + ATP + H2O
==> Reação total
AH2 + B + Pi + ADP -(eq)-> BH2 + A + ATP + H2O
PROBLEMAS TEORIA:
- Se desacoplador –> “descarga” de A~X => libertação de A e, cadeia de transporte electrónico continuaria. Bem, MAS: devia haver algo dif. na OXPHOS pq desacopladores não tem efeito na fosforilação (3-fosfato de gliceraldeído desidrogenase) + não afectam enzimas que sintetizam/ usam ATP.
- Apesar de esforços intensivos, nunca se identificou o composto reactivo necessário para acoplamento!
- hipótese não explicava pq é necessário que membrana mit esteja intacta p/ haver acoplamento entre a respiração e OXPHOS
Hipótese do acoplamento conformacional(Boyer, 1964)
Mecanismo de Acoplamento
Passo 1 – transformação de energia
AH2 + B -(eq)-> A* + BH2 Passo 2 – transmissão de energia A* -(eq)-> X* Mecanismo de formação de ATP Passo 3 – transformação da energia X* + Pi + ADP -(eq)-> X + ATP + H2O
- estado de mudança de conformação (mais energético)
PROBLEMA TMB:
falta de suporte exp, não se descobriu X, A…
Hipótese do acoplamento quimiosmótico (Mitchell, 1961)
PN 1978, receção hostil… mto inovador
quimiosmótica: reacções quím. podem propulsionar/ ser propulsionadas por movimentos de mols ou iões através de espaços osmoticamente distintos separados por membranas!!
–> general principle of coupling by proticity (protonic analogue of electricity), not by direct chemical or physical contact between the redox and reversible ATPase systems
Postulados da hipótese quimiosmótica
1 - ATP sintase = ATPase quimiosmótico, reversível, loc. na membrana com estequiometria H+/P característica;
2 - Cadeias respiratórias/ fotossintéticas = sistemas locs. na membrana com estequiometria H+/2e- característica e mesma polaridade de translocação de H+ para a sua atividade redox normal que ATPase tem para hidrólise do ATP
3 - Há sistemas de transporte dependentes de H+ (ou de iões OH-) para estabilização osmótica e transporte de metabolitos;
4 - Todos estes locs. numa membrana isolante, top. fechada, que atua como barreira osmótica não aquosa com baixa permeabilidade para solutos em geral (H+ e OH- em particular) Ex: membrana mit. interna, membrana tilacóide nos cloroplastos, membrana plasmática das bactérias.
(postulado 2)
As membranas que fazem transdução de energia têm bombas de protões (que utiliza e-das oxidações/ é propulsionada por fotões (hv)) com a mesma orientação:
nos mit/ bacterias:
N (matriz) –> P (espaço intemembranar/exterior)
(nas bacterias: ciclo de transporte eletrónico)
nos tilacoides ao contrário! (Vai de fora para dentro, fluxo eletrónico ‘uphill’)
ATP sintase atua na direção da hidrólise do ATP, quando bombeia protões do lado N para o lado P.
!!A direcção de funcionamento do ATP sintase/ATPase depende do valor do gradiente electroquímico protónico
Hipótese quimiosmótica
energia de Gibbs libertada pelo transporte electrónico armazenada sob forma de diferença de potencial electroquímico (devida às diferentes [H+] nos dois lados da membrana mit interna)
(tirar H+ –> aumenta pH;
diferenças de pH e potencial eléctrico através da membrana = força condutora que puxa os H+ do espaço intermembranar novamente para a matriz)
A direção de funcionamento do ATP sintase/ATPase depende do valor do gradiente electroquímico protónico
Analogia circuitos protótipos e elétricos
- Ambos têm geradores de uma diferença de potencial (pilha/ cadeia resp)
- Ambos os potenciais expressos em mV
- Ambos os potenciais podem ser usados para fazer trabalho (luz/ síntese ATP)
- A corrente que flui em ambos os circuitos obedece à lei de Ohm (I = V/R ou I = VG) (! bio… há desvios..)
- A velocidade de conversão química na bateria (ou na cadeia respiratória) está fortemente ligada à corrente de eletrões (ou protões) que flui no resto do circuito, a qual por sua vez depende da resistência do circuito
- Ambos os circuitos podem ser curto-circuitados (protonóforos)
- Potenciais caiem quando a corrente aumenta (pq resistência interna na pilha/ cadeia de transporte el.)
