Introdução ao transporte el. mitocondrial

Question 1

Estudos c/ espetrofotometria, eletrodo de O2 e inibidores: teoria geral

Answer 1

Britton Chance (Chnce & Williams, 1956)

–> determinar o caminho seguido pelos electrões ao longo de uma cadeia de transporte el

Condições normais: transportadores parcialmente ox

+inibidor específico:
oxidação dos pós (dão ao O2, não voltam a ser red) e redução dos pré (recebem e-, não doam)

Condições anaeróbias:
transportadores totalmente red

+O2 subito: onda crescente de ox (transportador –> forma parcialmente oxidada; demora maior para os componentes no início da cadeia)

Question 2

Tipos de espetrofotómetros etc

Answer 2

Espetrofotómetro de feixe dividido (1 monocromador, depois posição alternada do monocromador–> luz alterna entre 2 cuvettes; uma no estado ox outra no red) –> espetros diferenciais= red-ox

Espetrofotómetro de duplo monocromador (2 monocromadores de lambda difs fixos (1 para ótimo, outro para ponto isosbéstico pro, sem variação esperada), luz que passa pela cuvette varia entre 2 lambda, resto igual…)–> seguir cinética/ alterações estado stat. na abs de componente em suspensões turvas

+melhorar resolução: juntar aparelho para misturar (espécies que se formam de forma transiente)

Question 3

Espetros diferenciais

Answer 3

Espetro dif red - ox de mt em anaerobiose com beta-hidroxibutirato:

NAD+–> NADH pico a 340 nm

Espetros semelhantes com outros substratos que levam à formação de NADH (ex: malato, a-cetoglutarato)

vs. Succinato sem pico a 340 nm! (Pq não leva à formação de NADH, mas FADH2)
-as flavinas são reduzidas parcialmente pelo succinato, completamente por succinato + malato
-Adição ditionito de sódio (N2S2O4) a mt com beta-hidroxibutirato/ succinato:
não havia praticamente qualquer redução dos citocromos!

–>Qualquer substrato normal da respiração capaz de reduzir todos os citocromos da membrana interna do mt

-e- vindos da ox. do succinato (FADH2) entram na cadeia por via dif dos e- vindos dos substratos formadores de NADH. AMBAS VIAS DESEMBOCAM NA UBIQUINONA

–>TODOS CITOCROMOS E UBIQUINONA PERTENCEM A REDE COMUM ALIMENTADA POR DIVERSAS FLAVOPROTEÍNAS DADORAS DE E-

NADH –> FMN
e succinato –> FAD

ambos –> [Q, cit b] –> [cit c, cit c1] –> cit a –> cit a3 –> O2

Question 4

Inibidores

Answer 4

NADH DH:
Rotenona (inseticida)
Amytal (barbitúrico)
Piericidina A

Succinato DH:
Malonato

Na zona dos cyt b:
Myxothiazol
Antimicina A

Citocromo c oxidase (a3?):
CO, CN-, N3-

Question 5

Crossover Point

Answer 5

local de ação dos inibidores! (ponto onde se altera estado red–>ox)

ex: + CO/CN- –> todos transportadores el + red
(pq bloqueiam cyt a3 no final da cadeia –> e- não saem para O2)

+antimicina A: flavinas, cyt b mais red, outros mais ox–> bloqueia entre cyt b e cyt c1 (mas estudos… ver dps) não inibe red UQ –> quinona encaixa-se antes dos cyt

Question 6

Estudos cinéticos

Answer 6

c/ espetrofotómetro de duplo monocromador (erros de dispersão de luz minimizados)

Mt + succinato –> consumo O2 com v constante
cyt c aceita e- (de cyt c1) e doa a cyt a –> só parcialmente red –> ESTADO STAT AERÓBIO

• % red –> + perto O2

Question 7

Estudo c/ eletrodo O2

Answer 7

solução tamponada com ADP e Pi equilibrada na câmara de um eléctrodo de O2. reagentes injectados na câmara, consumo de O2 registado:

1. Mt e beta-hidroxibutirato injectados na câmara. mt catalisam a ox. do beta-hidroxibutirato –> NADH e acetoacetato. NADH oxidado pela cadeia de transporte electrónico com o O2 como aceitador terminal –> [O2] diminui.
2. • rotenona/ amytal pára oxidação do beta-hidroxibutirato
3. • succinato ( sofre ox ligada ao FAD) –> diminuição O2. –> e- do FADH2 capazes de red. O2 com rotenona = e- do FADH2 entram na cadeia de transporte elet. depois do passo bloqueado pela rotenona!
4. • antimicina A inibe o transporte elet. partindo do FADH2.
5. Embora NADH e FADH2 sejam os dadores el. fisio. da cadeia respiratória, agentes red. não fisio. podem ser usados para sondar fluxo de e-: + TMPD (tetrametilo-p-fenilenodiamina, transportador redox redutível pelo ascorbato que transfere e- directamente para o cyt c) e ascorbato ao sistema reaccional inibido pela antimicina A –> novo consumo O2 –> 3º local de entrada de e- na cadeia de transporte elet.
6. • CN- inibe completamente a ox. dos 3 dadores de e-, indicando que bloqueia a entrada de e- depois do 3º ponto de entrada