Ottica Flashcards
Parti di un microscopio ottico
- Sorgente di luce (interna o esterna)
- Condensatore (concentra la luce sul campione)
- Lenti dell’obiettivo (mettono a fuoco il campione, più fotorecettori ci sono nelle lenti, maggiori saranno le informazioni e i dettagli resi, sino al limite della diffrazione)
- Lenti dell’oculare (ingrandimento operato sull’immagine dell’obiettivo e produzione di immagine virtuale. Maggiore è ingrandimento maggiori saranno i dettagli, fino al limite di diffrazione oltre il quale si ha INGRANDIMENTO A VUOTO)
- Le ultime lenti sono gli occhi umani
Cos’è l’ingrandimento?
Prodotto tra ingrandimento obiettivo e ingrandimento oculare (i due sistemi di lenti)
Limite di risoluzione occhio umano e microscopio ottico
- Occhio umano: 0,1 mm
- Mic ottico: 0,2 micrometri o 200nm
Risoluzione da che dipende
La risoluzione è limitata dalla lunghezza d’onda
(Maggiore è la lunghezza minore sono i dettagli rilevati perché il raggio è grosso)
d= 0,61 lambda
n sen alfa
Distanza minima dalla quale due oggetti devo esser separati per esser visti.
Lambda=lunghezza d’onda
n=indice di rifrazione del mezzo
Alfa= semi angolo del cono di luce che entra nell’obiettivo, per effetto della rifrazione
Apertura numerica
Indice di rifrazione del mezzo per seno di alfa (semiangolo luce che attraversa l’obiettivo)
In aria è uno (n aria 1, massimo angolo rifrazione in aere 1)
Visibilità
Li visibilità è definibile come contrasto, noi vediamo le cose infatti se queste interagiscono con la luce differentemente le une dalle altre e rispetto allo sfondo
Preparazione del campione
Può essere in toto ma spesso è in sezione (piccolo è meglio, not too big)
1) uccisione molecola (colorazione di Feugen per DNA e altri trattamenti richiedono in sostanza la morte della cellula o l’oltrepassarne la membrana, che porterebbe a tale sorte)
2) Fissazione (penetrare e immobilizzare la cellula allo “stato vivente”, fissativi sono formaldeide e acido acetico)
3) Disidrazione attraverso una serie di alcoli
4) Taglio con sostegno di Paraffine (cera) che aiutano (tirano,fermano)
5) Facile rimozione paraffine (caratteristica a loro vantaggio) spesso tramite TOLUENE
6) Colorazione e/o trattamenti
7) Apposizione vetro copri oggetti (deve avere lo stesso indice di rifrazione del porta oggetto)
Microscopio a campo chiaro
Sfondo luminoso
Si vedono corpi in forte CONTRASTO
Microscopio in contrasto di fase
Converte differenti capacità di interagire con la luce delle diverse parti di un corpo e/o cellula in differenze fotocromatiche
Ove ci sono forti differenze produce aloni
Più precisi DIC (mic. interferenziale differenziale) o NOMARSKI
Ottimo per corpi traslucidi tipo le cellule
Microscopia a fluorescenza
- Permette di esaminare elementi dinamici
- Utilizza fluorocromi o fluoroFORI, molecole che assorbono radiazioni ultraviolette riemettendo luce visibile (fluorescenza)
- Poiché la sorgente della luce è ultravioletta (oltre il visibile) lo sfondo è scuro e il contrasto perfetto rende l’immagine nitida
Immunofluorescenza
Una delle prime tecniche dei microscopi a fluorescenza, lega il fluorocromo ad un ANTICORPO che localizza una specifica proteina
GFP
Proteina fluorescente estratta dal corredo di una medusa (AEQUOREA VICTORIA) la GFP (green fluorescent protein) a differenza di molte altre proteine è in grado di assorbire e riemettere luce senza utilizzo di cofattori tramite modifiche endogene pure.
Viene associata a regioni della cellula e/o geni del DNA
Ne esistono diverse varianti che permettono l’analisi parallela di diverse parti di una stessa cellula (es YTP, Yellow fluo protein, CTP, ciano fluo protein…)
FRET
Trasferimento di energia per risonanza (amplificazione delle onde) o all’inglese (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
È utilizzata per misurare la distanza fra due corpi.
La FRET si basa infatti sul fatto che l’energia di eccitazione può essere trasferita da un fluorocromo/fluoroforo donatore ad un fluorocromo/fluoroforo accettore.
Quanto più i gruppi sono vicini, tanto più il trasferimento sarà efficiente.
In pratica le variazioni di luminosità di un fotocromo o dell’altro suggeriscono un cambiamento nella distanza fra i corpi interessati nella misurazione
Microscopio confocale a scansione laser
- utilizza laser (piccola lunghezza d’onda) che permette di marcare una piccola parte di un campione
- di solito si basa su tecniche di fluorescenza
- il raggio riemesso dal campione, di lunghezza d’onda maggiore, riesce a penetrare nell’apertura minuscola del diaframma
- il principio alla base di ciò è che il piano del campione/sezione illuminata e quello dell’apertura sono CONFOCALI, hanno cioè stesso fuoco (punto in cui i raggi di luce s’incontrano)
Il mic. Confocale permette di superare il problema tale per cui i punti sopra e sotto il piano focale interferivano con la resa dell’immagine, con il suddetto microscopio infatti i raggi emessi da punti estranei al piano focale non entrano nella minuscola apertura (sono quindi invisibili) del diaframma e la sezione appara nitida e in forte contrasto
Basofilia e acidofilia
1) affinità per basi (Baso Filia)
2) affinità per acidi (acido filia)
Ematossilina
Colorante di norma utilizzato per sostanze cariche negativamente, basi.
Il colore che conferisce è blu
Remember: blu=basic
Eosina
Colorante di contrasto all’ematossilina, evidenzia le molecole cariche positivamente, acidi, eosinofili/acidofili
Il colore che conferisce è rosso
Remember: rosso=acid
3,3 diaminobenzidine = DAB
Composto organico usato per la colorazione di ACIDI NUCLEICI E PROTEINE
Solubile in H2O nella forma non ossidata
Forma un precipitato bruno (e insolubile) quando ossidato
La reazione di ossidazione è catalizzata da una perossidasi
Il diaminobenzidine tretre è anche detto DAB!
Immunoistochimica
La tecnica immunoistochimica si basa sul principio di coniugazione antigene-anticorpo in addizione poi con sistemi di rivelazione (enzimatici, fluorescenti) che ne rendono visibile l’avvenuta reazione al microscopio. Esistono metodiche dirette o indirette.
Nel caso dell’enzima, un enzima catalitico sviluppa la reazione interagendo con un substrato cromogenico (es. diaminobenzidine o DAB).
Immunoistochimica vs Immunofluorescenza
Immunoistochimica (reazione con enzima catalitico e substrato cromogenico tipo DAB) può considerarsi un metodo INDIRETTO perché sfrutta i meccanismi di reazione
Immunofluorescenza è invece un metodo diretto perché il campione è DIRETTAMENTE colpito dalla luce
