Observation Flashcards
Comment fonctionne le principe d’un microscope électronique ?
Électron bombarde l’échantillon (au lieu des photons)
qu’est-ce qui différent entre microscope optique et électronique ?
Le grossissement
(longueur d’onde photon vs longueur d’onde electron)
c’est quoi l’anatomie du microscope (en haut jusquen bas)
- lentille (occulaire)
- objectif
- échantillon
- condenseur
- lampe
Il est ou le condenseur
entre l’échantillon et la lumiere
Qu’est-ce qui aggrandit ?
objectif 1er fois, occulaire 2e
Le meilleur microscope photonique peut aller à un grossissement jusqu’è combien ?
objectif 200x
occulaire 15x
-> 3000x
quel sont les 3 aggrandissement courrantes chez les microscopes photnique ?
100x
400x
1000x
c’est quoi une limite de résolution?
distance minimal entre deux points pour pouvoir les distinguer
comment on calcul la limite de résulotion? (2)
= longueur d’onde /2n sin( 1/2 angle cone de lumière entrant dans l’objectif)
- 0,5 longueur d’onde /nsin(1/2 angle)
c’est quoi le n dans la limite de résolution?
indice de refraction du milieu
l’ouverture numérique (NA) peut remplacer quoi dans la formule ?
nsin(1/2 angle)
(écrit sur les objectif)
Quel facteur pouvons nous intervenir pour aider les facteurs limitants. quoi pour rempalcer:
-> Longueur d’onde lumière visible
UV (180-> 400nm)
-doit mettre objectif en quartz, car UV passe pas les vitres
- doit mettre une transformation optique = pour voir au visible, mais perd résolution
Quel facteur pouvons nous intervenir pour aider les facteurs limitants. quoi pour rempalcer:
-> indice de refraction du milieu
mettre dans du verre = 1,5
huile immersion = 1,56
(faisceaux lumineux dévient moins )
indice de refraction de l’air = ?
1.0
on peut toujours mettre de lhuile à immersion? habituellement utilisé ou?
Faux.
doit être écrit qu’on peut.
objectif à fort grosissement (60-100x)
on veut que la distance entre l’objectif et l’échantillon soit grand ou petit ? ce qui donne une angle plus grand ou petit ?
petite distance, grand angle
Meilleure est l’ouverture numérique (NA) plus quelle est grande ?
Vrai
le meilleur microscope photonique a une limite de résolution de combien?
0,1 u
(lumière blanche, la limite = 0,2u)
c’est quoi le contraste ?
il est proportionnel à quoi?
capacité à distinguer une structure de son environnement
-> quantité de lumière absorbé
c’est quoi le microscope à fond clair ?
qui la découvert ?
structure sombre sur fond clair
Kohler
Quelle sont les limitations du microscope à fond clair ?
sert à quoi spécialement
-> doit être de gros m-o
-> voir la mobilité (état frais)
-> morphologie
Désavantage du microscope à fond clair à l’état frais ?
Pas de contraste
Comment pouvons nous augmenter le contraste dans un microscope à fond clair ?
désavantage ?
-> coloration
-> ne peut se faire sur organisme vivant (exigent fixatif)
comment les colorants fonctionnent ?
chargé -/+ = s’attache
hydrophobe = s’insère lipide de membrane
c’est quoi une coloration simple ?
exemple ?
coloration uniforme
-> Bleu de methylène (chargé +)
Pourquoi le Bleu de methylène marche bien ?
majorité m-o ssont chargé - = s’Accroche bien.
comment o fixe une couleur ?
- Seche echantillon (flamme = fixe)
- trempe coloration
- rince
c’est quoi une coloration différentielle ?
exemple ? (2)
capacité de prendre un pigment plus que l’autre
-> Gram
-> Alcoolo-acido-resistante (mycobactérie)
Comment la coloration de Gram fonctionne ?
rétention du crytal violet
-> chargé + retiennent violet
- chargé - retiennent le rouge
(couleur opposé = discerne bien)
comment fonctionne la coloration alcoolo acido résistante ?
retient colorant rouge/rose malgrès le lavage a l’alcool et à l’acide
(le reste relache)
grosse différence entre coloration simple et différentiel ?
Simple: colore tout
différentielle: descrimine organisme voulu
autre coloration différentielle autre que gram et AAR?
-> endospore
-> capsule
-> flagelle (grossit = pas de coloration)
-> corps d’inclusion (N, S, P…)
c’est quoi le microscope à fond noir ?
différence avec le fond clair normal?
clair sur fond noir (rien ne dévie la lumière)
Dans le condensateur:
-> Cone d’Abbé + miroir
-> éclairage oblique (X)
-> visualise seulement les rayons déviés
Avantage fond noir ?
pas de fixation, pas de coloration
=> possible voir cellule vivante
c’Est quoi le microscope à contraste de phase ?
différence avec le normal?
on joue avec la physique pour aider
fond est clair
-> condensateur + objectif avec anneaux de phase
-> filtre coloré
Principe microscope à contraste de phase ?
Mise en phase de la lumière incidente
= réfraction lumière par les structure cellulaire
= change de phase
= change d’intensité de la lumière
avantage microscope contraste ?
cellule vivante (pas fixation/coloration)
voit mieux (mais Halo)
Comment reconnaitre microscope à contraste?
Halo
Principe d’un microscope à contraste d’interférence différentielle ?
Différence visuelle ?
différence microscope ?
fonctionne par modification de la. lumière polarisé = intensité lumineuse différente
-> coloré et impression de relief
->. condensateur a un système de lentille polarisante contrôler par informatique
Avantage microscope à contraste d’interférence différentielle ?
-> sans coloration ni fixation
-> cellule
-> absence de Halo
Limites du microscope à contraste d’interférence différentielle?
préparation transparente
mince
(la lumière doit pouvoir traverser)
extrêmement cher
Principe du microscope à (epi)fluorescence ?
différence avec le microscope normal ?
Utilse le UV.
-> colorant fluo
-> lampe UV excitatrice
-> filtre selectif (bloque)
-> Miroir dichroique (2 couleurs)
différence entre microscope epifluorescence et fluorescence ?
différence par comment la lumière est émise et récolté
-> epifluorescence la lumière emise et récolté même place
avantage microscope à fluorescence ?
-> colorant fluo vitale
-> cellule vivante
-> permet de voir cellule vivante vs cellule morte
-> permet utiliser immunofluorescence (anticorps spécifique)
Comment on peut reconnaitre les cellules vivantes vs mortes daans un microscope à fluorescence ?
Morte: membrane cytoplasmique perméable = entre = diffuse
Vivante: exclu par la membrane =
à quoi sert l’immunofluorescence
comment c’Est fait ?
sert à trouver pour reconnaitre
-anticorps + fluorochrome
-> s’accroche cible seulement et éliminer si pas de cible
C’est quoi la microscopie FISH?
Fluo in situ hybridization
-> sonde ADN fluo spécifique
différent fluorochrome pour différente espece = va détecter espece précise
(quantification)
Grossièrement, à quoi sert:
-immunofluorescence (et limites)
- fluorochrome vitaux
- FISH
-> diagnostic (détection)
limite: sensibilité des anticorps (affinité)
-> proportion morte/vivante
-> quantification des proportion
+ analyse informatique d’image
Microscope électronique ont été inventé quand, par qui?
but ?
Ruska
(Nobel en 1986)
voir des petits m-o
différence entre le grossissement, la longueur d’onde et limite de résolution microscope électronique vs photonique ?
Photonique :
1000x et 0,1u
longueur d’onde photon= 5x10^-7
Électronique:
400,000 x et 0,05u
longueur d’onde électron = 5x10^-12
Le microscope électronique a quoi de plus ? quoi ca sert?
- électro-aimant
- lentille magnétque (car traverse ni le verre, ni le quartz)
(sert à moduler faisceaux d’électrons)
Le microscope électronique doit être situer ou? pourquoi?
sous-sol
-> moins de vibration
Avec quel objet ont peut détecter les images du microscope électronique ?
pourquoi besoin de ca ?
- écran fluorescent
- plaque photographique
- détecteur numérique
-> longueure d’onde non visible à l’oeil nu, besoin instrument pour visualiser
limite microscope à électron?
- électron voyagent dans le vide = intérieur doit être vide = cellule non vivante (majorité)
- électrons sont non-pénétrantn = doit être coupe ultrafine (20-100 nm)
= possible altération car pour couper fin = rigide
- contraste très bas = doit être coloré
Comment on colore les coupes de microscopie électronique ?
matériaux impérméable électron = métaux (fer, or, uranium, lanthane)
ou acide phosphotungstine
c’est quoi les types de coloration pour le microscope électronique ?
- ‘ombrage (shadow casting)
- Coloration négative
- cryodécapage
- immunolocalisation cellulaire
Comment fonctionne la coloration d’ombrage (shadow casting)
vaporise métaux à un angle précis = projette ombre
+ bille témoins servent pour comparer les ombres pour déterminer l’élévation
Comment fonctionne la coloration négative ?
utile dans quoi?
trempe dans l’Acide phosphotungstine
= accumule dans les creux = sombre = accumule électrons
= relief
-> structure virus
Comment fonctionne la coloration cryodécapage ?
congèle (-180c)
-> coupe transversal = fracture zone de faiblesse
= ouvre cellule
+ technique ombrage
= voit dans l’échantillon
comment fonctionne la coloration d’immuno-localisation cellulaire
anticorps spécifique + bille Fe ou Au
= localise prot dans la cellule
-> doit être coupler sinon voit pas
c’est quoi les deux types de microscope électronique ?
- transmission
- à balayage
comment fonctionne le microscope à transmission?
limite ?
- Électron traversent l’échantillon
-> détecteur sous l’échantillon (image par transparence) = doit être mince mince
-> limite de résolution faible (le plus faible des microscopes électronique)
Comment fonctionne le microscope à balayage ?
balais surface échantillon
= électron réfléchis (détecteur latéral)
= effet 3D
Comment fonctionne la cryoélectromicroscopie ?
congèlation rapide -135 (azote liquide)
= conserve l’intégralité des structures sous vide
(Cryo-EM) = modélise des structure protéique (comme virus, spike)
= une image à la fois = reconstruction 3D par l’ordinateur
Comment fonctionne le microscope confocal à balayage laser ?
avantage ?
-> illumitation laser UV
-> utilise fluorochrome
-> détecte exclusivement par plan au foyer et élimine fluo si hors foyer
-> balais horizontale, vertical, temporel
-> reconstruction + quantification ordinateur (3D ou 4D)
=> + de contraste et - d’interférence
à quel moment on utilise le microscope confocal à balayage laser ?
- détection ou localisation structure dans cell ou tissu
- développement biofilm dans le temps
- quantification + positionnement cell morte/vivante
Comment fonctionne le microscope à balayage de sonde ?
qui la inventé ? quand ?
(effet tunnel)
sonde balais la surface = mesure le déplacement hori/verti et le courant entre les nuages électronique
- grossissement 10^8
-> lien intermoléculaire
-> observation en milieu aqueux
-> Rohrer et bining 1989
À quoi sert les billes dans le microscope électronique?
Savoir environs la hauteur des structures
différence entre microscopie électronique à transmission ou à balayage ?
Transmission: transparence dans les photos (voit à travers)
Balayage: ne voit pas du tout à travers
