Nukleinsäuren Flashcards
Für was werden Nukleinsäuren im Körper verwendet?
Informationsträger Regulation Katalyse
Wofür wird die DNA-Diagnose verwendet?
- Nachweis von Erbkrankheiten (pränatale Diagnostik, Familienberatung)
- Frühdiagnose von Infektionskrankheiten (z.B. AIDS, Hepatitis)
- Transplantationsanalysen Expressionsmuster (individualisierte Arzneimitteltherapie)
- DNA-Diagnostik DNA-Fingerprint (Gerichtsmedizin) Lebensmittelanalyse (z.B. EHEC-Bakterien)
Wofür wird Gentechnik verwendet?
- Produktion Arzneimittel
- Gentherapie
- “grüne” Gentechnik
Genom
Gesamtmenge der DNA einer Zelle enthält die vollständige genetische Infornation eines Organismus in jeder Zelle vorhanden 3 Mrd Basenpaare (Mensch)
Gen
- DNA Abschnitt der für die Synthes eines Proteins, einer rRNA oder tRNA erforderlich ist
- ca. 30.000 Gene (Mensch)
Was umfasst das humane Genom
- mitochondriale und nukleäre DNA ( -> 75% extragenisch, 25% Gene ( -> 90% nicht codierend, 2% codierend)) → nur 2% der DNA wird in Proteine umgesetzt
Aufbau DNA
- 4 Nucleotide (Nucleobase, Zucker(Desoxyribose), Phosphat)
- lange unverzweigte Kette in 2 gegenläufigen Strängen zur Doppelhelix
Pyrimidin (Thymin, Uracil, Cytosin)
Purin (Adenin, Guanin)
Thymin
Cytosin
Uracil
Adenin
Guanin
Nucleosid
- Zucker + Nukleobase
- Nukleoside (Adenosin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Thymidin)
Wofür braucht man Nuklkeotide?
- Bausteine der Nukleinsäuren
- Energiereiche Verbindungen (ATP, Acetyl-CoA)
- Coenzyme (ATP, NADH, Coenzym A)
- Signalmoleküle (cAMP)
Was für Arten von Doppelhelixen gibt es?
- B-Helix: normale Form von der DNA
- A-Helix: typisch für DNA/RNA und RNA/RNA-Helices
Stabilsierende Kräfte der B-Helix
- H-Brücken zwischen den Strängen, trägt nur wenig zur Stabilität bei
- Wechselwirkung mit Wasser (Hydrathülle und Kationen (Abschirmung der negativen Ladung)
- Stapelwechselwirkung: Wechselwirkung zwischen den π-Elektronen übereinander gestapelter Basen
- (Sequenz abhängig: GC-reiche Abschnitte sind stabiler als AT-reiche Abschnitte → AT-reiche Abschnitte erleichtern die Strangtrennung
Was sind die die kleine/große Furche der Doppelhelix?
- durch das Umeinanderwinden der beiden Strängen entstehen seitliche Lücken
- dort liegen die Basenpaare besonders offen ⇒ gut von außen erkennbar, Enzyme setzen gern an der großen Furche an
Beschreibe kurz die Replikation und die dafür benötigten Enzyme.
- Entwindung der Doppelhelix durch Helicase
- lösen von Verdrillungen durch Topoisomerase
- Synthese von DNA durch Polymerase (5´→ 3´)
Vergleich DNA/RNA (kleiner Text zum Lesen)
- Phosphorsäurediesterbindung in der DNA viel stabiler, da Wasser nicht über die zusätzliche Hydroxygruppe “angreifen” kann
- Uracil statt Thymin
- RNA liegt überwiegend als Einzelstrang vor
- neben Watson-Crick-Paarung (AT, GC) auch andere Basenpaarungen realisert → strukturelle Vielfalt
- enthält modifizierte Basen (zB durch Deaminierung und Methylisierung) → strukturelle Vielfalt
- strukturelle Vielfalt bedingt funktionelle Vielfalt (mRNA, rRNA, tRNA, weitere RNA-Formen zur Regulation, Struktur, Katalyse)
Primäres Karzinogen
- ohne metabolische Aktivierung
sekundäres Karzinogen
- erst durch Biotranformation krebserregend (=Prokarzinogen)
Kokarzinogen
- direkte Erhöhung karzinogener Effekte
- z.B durch Induktion biotranformierender Enzyme
Promotoren
- indirekte Erhöhung karzinogener Effekte durch Proliferationsreiz
Genotoxizität
Eigenschaft zur Schädigung des Erbgutes (erbgutveränderndes, Krebserzeugendes, missbildend), eines Stoffes oder physikalische Einwirkung
Benzopyren
- Prokarzinogen
- entsteht bei Verbrennung von organischen Stoffen (Grillen, Rauchen)
- hydrophob
- wird durch den Biotransformator Cytochrom P-450-Enzym modifiziert zu einem Karzinogen das mit Guanin reagieren kann
Nitrosamin
- Prokarzinogen
- entsteht aus Nitrit (NO2- & Amin +Hitze/Säure) und aus Tabak+Hitze
- Nitrosamin wird durch den Biotransformator Cytochrom P450-Enzym zu einer karzinogenen alkylierenden Verbindung modifiziert → Alkylierung (Methylierung aller 4 Basen möglich (vorher G-C, nacher metG-T)
UV-Licht
- physikalisches Karzinogen
- 1-380nm
- DNA und RNA absorbieren UV-Licht (260nm) → Anregung der π-Elektronen der Nukleobasen → Thymin verbindet sich mit benachbarten Basen zu Thymindimeren
endogene genotoxische Faktoren
- Oxidation von Nukleobasen durch “reactive oxygen species” (ROS) zB H2O2 und andere Radikale
- Cytosin zu Uracil/Thymin durch hydrolytische Desaminierung
Folgen von DNA-Schäden
- chromosomale Abberation
- Punktmutation
- Deletion
- DNA Amplifikation
►
- metabolische Veränderungen
- Onkogenaktivierung
- Immortalisierung
- Tumorsupressorgeninaktivierung
Vielschrittkarzinogenese
Genotoxischer Stress → Zellschädigung /Reparatur oder Apoptose durch p53 möglich → genetisch Veränderte Zelle (Apoptose oder Seneszenz durch p53 möglich) → unkontrolliertes Zellwachstum (Inaktivierung von p53) → Verlust weiterer Wachstumskontrollen (mut p53) → Primärtumor (mut p53) ⇒ metastasierender Tumor
- Tumorinitation -> Onkogenaktivierung -> Tumorpromotion -> Tumorprogression
Humanes Papillomavirus (HPV)
Biologisches Karzinogen
- DNA wird ins Wirtsgenom aufgenommen
- Onkogene werden permanent gebildet
- eines dieser Onkogene bindet an p53 und inaktiviert dieses → erhöhter Risikofaktor für Krebs
Zytostatikum Cisplatin
- Komplexverbindung: Pt(NH3)2Cl2
- Zentralion Pt2+
- Liganden NH3Ammoniak) und Cl- (Chlorid)
- Chlorid-Liganden werden in den Zellen durch H2O erstzt, da es intrazellulär weniger Chlorid gibt → Cisplatin kommt nicht mehr aus der Zelle hinaus → statt H2O-Liganden verbinden sich Stickstoff zB aus den Nukleobasen ⇒ Nukleobasen werden verbunden
Dexorubicin
- planares Molekül → Interkalation: Einlagerung planarer Moleküle zwischen die gestapelten Nukleobasen
PCR
Exponentielle Vermehrung eines DNA-Fragments
3 Reaktionsschritte:
- Denaturierung (95°C): doppelsträngige DNA wird gespalten
- Hybridisierung/Annealing (50-60°C): Primer lagern sich an komplementären Bereiche der Matritze an
- Extension/Elongation (72°C): DNA-Polymerase verlängert Primer in Richtung 5´→ 3´
Primer
- DNA-Molekül
- Oligonucleotid
- 20-40 Basenpaare
- DNA-Polymerase setzt an 3´Ende an und verlängert es
STR
- short tandem repeats, Mikrosatellit
- eine sich wiederholende Sequenz in dem nicht codierenden Bereich der DNA mit 2-7 Basenpaaren
- 10-107 Wiederholungen
VNTR
- variable number of tandem repeats, Minisatellit
- eine sich wiederholende Sequenz in dem nicht codierenden Bereich der DNA mit 10-150 Basenpaaren
- 10-107 Wiederholungen
Genlocus D1S80
- VNTR auf dem distalen Ende des Chromosoms 1 gelegen (Map-Position 80)
- Core-Sequenz besteht aus 16 BP
- 29 verschiedene Allele beschrieben (14-42 Wiederholungen)
Viren
- infektiöse Partikel ohne eigenen Stoffwechsel
- bestehen aus Nukleinsäuren & Protein (+/- Lipidhülle)
- Vermehrung in lebenden Wirtzellen
- obligate intrazelluläre Parasiten
Viren schematischer Aufbau
- Kapsid: viruskodierte Proteine
- Genom: DNA oder RNA
- Lipiddoppelmembran (nicht bei allen Viren)
instrumentale Vergörßerungsmöglichkeiten
- Lichtmikroskop: 10-2,7
- Elektronenmikroskop: 10-4-10-7,5
- Röntgen-Strahlung: 10-7 - 10-10
- NMR-Spektroskope (Kernspin-Resonanz): 10-8 - 10-10
Unterteilung Viren nach Genom
- RNA: ds/ss(+/-) ⇒ segmentiert/kontinuierlich
- DNA: ds/ss(+/-) ⇒ linear / zirkulär
- (+)= mRNA-Strang (-)= RNA muss erst noch transkribiert werden + eigene Polymerase
Virusnachweise
- PCR, Antikörpernachweis
- (wenn virales RNA-Geom: reverse Transkription und dann PCR)
HIV
- Familie: Retrovidae
- Genom: ss (+) RNA; 2 identische Stränge 9,2 kB
- Replikation: Reverse Transkriptase (RT)
- Kapsid: konisch
- Größe: 80-100 nm
- Hülle: ja
Azidothymin
- Nukleosid-Analoga, dient als RT-Inhibitor
- Nukleotid mit einem N3-Molekül am 3´-Ende → Kettenabbruch
- wird von der humanen Polymerase nicht erkannt, nur von der Reversen Transkriptase
- ⇒Bekämpfung HIV
Herpesvirus
- 150-260kB großes, ds-DNA-Gneom
- kodiert eigene Replikationsenzyme
Acycloguanosin
- Nukleosidanalgon
- Prodrug: ist inaktiv ohne Herpesvirus
- Überführung durch virale Kinase ins Monophosphat
- Überführung durch zelluläre Kinase ins Triphosphat
- als Substrat von viraler Polymerase akzeptiert
- DNA-Synthese ⇒ Kettenabbruch
Warum werde Viren erforscht?
- Viren als Infektionserreger
- Impfstoff-/Medikamententwicklung
- Überwachung neuer Viren
- Effiziente Virus-Wirtsinteraktion
- Werkzeug in Molekularbiologei, Zellbiologie und immunologie
- Einsatz ini moderner Biomedizin
- Rekombinante Viren als maßgeschneiderte Impfstoffe
- als cytolytische Virus-Vektoren in der Tumortherapie
- als Gentranfer-Vektoren in der Gentherapie
Phänotypische Stigmata bei Morbus Down
- Kraniofaziale: Brachyzephalus (hoher, flacher Schädel, mongoloide Lidachsen, Protrusion(Hervortreten der Zunge), Epikanthus(doppelte Lidfalte), Brushfield-Flecken im Auge
- Vierfingerfurche
- Sandalenlücke
- Muskelhypotonie
- Trinkschwäche
- Organmanifestation (Herzfehler, Duodenalatresie, mentale Retardierung)
Pränatale Diagnostik bei Verdacht auf Morbus Down
- Ultraschall 11-13 Wochen nach letzter Menstruation (ersttrimesterscreening), wenn zB Nackenfaltentransparenz ⇒ Gewinnung fetaler Zellen durch Amniocentese (Punktion der Fruchtblase) oder Chorionzottenbiopsie (außen Seite der Amnionhöhle in der frühen Schwangerschaft)
- Diagnosestellung aus mütterlichem Blut mittels Shotgun-DNA-Sequenzierung
Die molekulargenetische Entsteheung von Trisomie 21 berscheiben.
- Nondisjunction in der 1. oder 2. meiotischen Teilung (Hauptrisikofaktor: Alter der Mutter)
- Nondisjunktion in nachfolgenden Mitosen: Mosaik
Verschiedene Formen von Trisomie 21 benennen.
- freie Trisomie 21: 47 Chromosomen ( >90% der Fälle)
- Translokationstrisomie 21: 46 Chromosomen (3-4% der Fälle), zB Robertson´sche Translokation (Fusion zweier akrozentrischer Chromosomen (13,14,15,21,22)
Phasen des Zellzyklus
- G1-Phase: mind 9-12h: Zellwachstum, Entscheidung: Zellteilung, G0-Phase oder Differenzierung
- S-Phase: 7-10h: Verdoppelung der 46 Chromosomen
- G2-Phase: ca 4h: Wachstum, Kontrolle, Korrektur
- Mitose, Cytokinese: Trennung der Chromatiden, Teilung der Zelle
DNA-Replikation
semikonservativer Vorgang
- Topoisomerase entwindet Doppelhelix, Helicase trennt Einzelstränge
- am Leitstrang (3´→5´) synthetisiert die DNA-Polymerase δ einen komplementären Strang in 5´ ->3´
- am diskontinuierlichen Strang (“lagging strang”) kann die Polymerase α auch nur in 5´->3´ und deshalb stellt die DNA-Primase kurze RNA-Primer her, woran die Polymeraseα in 3# richtung ansetzen kann und so kurze DNA-Fragmente (Okazaki-Fragmente) herstellt die dann durch die Ligase wieder zusammengefügt werden
strukturelle Besonderheiten eines Chromosoms
- 2 Chromatiden
- p-Arm (kurzer Arm (petit)), q-Arm
- Zentromer: hält Chromatiden zusammen (kann meta-, akro- oder submetazenrtrisch sein)
- Telomere: organisiert Ende der Chromatiden
Vererbungsmuster
- autosomal-dominant:: ♂/ ♀ gleich häufig, krankes Allel setzt sich bei Heterozygoterie durch
- autosomal-rezessiv: ♂/♀ gleich häufig, krankes Allel setzt sich bei Heterozygoterie durch
- x-chromosomal-dominant: ♂/♀ gleich häufig wenn krankes Allel von Mutter kommt, bei Vater ausschließlich ♀
- x-chromosomal-rezessiv: ♂ häufiger (muss von Mutter kommen), Doppel X bei ♀ kann krankes Allel “ausgleichen”
Wichtigste Entwicklungsschritte der Genetik zeitlich einordnen (7. Fakten)
1859 Evolutionstheorie (Darwins “On the Origin of Species”)
1866: Mendelsche Erblehre
1909: Eugenik (Francis Galton)
1911-1919: Bestätigung der Chromosomentheorie
1944: DNA ist Erbsubstanz/Genkonzept (Avery et al.)
1953: Franklin; Watson-Crick: Doppelhelixstruktur der DNA
2003: Humangenomprojekt (Sequenzierung der humanen DNA)
Zweck des Gendiagnostik-Gestzes und Anwendungsbereiche (rechtlicher Text zum lesen)
§ 1 Zweck des Gesetzes
Zweck dieses Gesetzes ist es, die Voraussetzungen für genetische Untersuchungen und im Rahmen genetischer Untersuchungen durchgeführte genetische Analysen sowie die Verwendung genetischer Proben und Daten zu bestimmen und eine Benachteiligung auf Grund genetischer Eigenschaften zu verhindern, um insbesondere die staatliche Verpflichtung zur Achtung und zum Schutz der Würde des Menschen und des Rechts auf informationelle Selbstbestimmung zu wahren.
§ 2 Anwendungsbereich
zu medizinischen Zwecken, zur Klärung der Abstammung, im Versicherungsbereich und im Arbeitsleben (nur in wenigen, sehr speziellen Ausnahmefällen gestattet !) nicht: Forschung, erworbene genetische Veränderungen (z.B. bei Krebserkrankungen)
Grenzen der Aussagekraft genetischer Diagnostik
- es kann immer falsch positive/negative Testresultate geben
- exogene Faktoren, nicht nur genetische Prädisposition wirken auf Phänotyp
- Test nicht sensitiv oder sensibel genug
populationsgenetische Argumente
- Argumente, die sich auf Vorteile für gesamte Population beziehen, zB Ausschaltung von Erbkrankheten
- z.B durch Zwangsterilisation
individualgenetische Argumente
- Argumente, die sich auf die Vorteile des Individuums (Mutter/Patient) beziehen
- z.B mögliche Früh-Behandlung, Beratung der Mutter
Präparation von DNA
- Hinzugabe von hypotoner alkalischer Lösung: Zerstörung der Zellhülle
- Erhitzen auf ca 95°C (5-10min): Denaturierung der proetein (einschließlich der Nukleasen) und der genomischen DNA
- Zusatz eines pH-Puffers: Neutralisation; pH-Optimum für die Polymerase(zusätliche Fällung)
