Molecular Diagnosis Flashcards
True or False,
Not all genetic variations are tied to phenotypes
TRUE
La plupart de ces variations n’ont pas d’impact phénotypique:
* Elles surviennent dans des régions non-codantes (régions intergéniques, introns) sans affecter
l’expression du gène
* Elles sont des polymorphismes fréquents
* Elles touchent un gène s’exprimant à l’état récessif, sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le
gène
Ilot CpG?
Les dinucléotides CG sont des endroits de prédilection pour les mutations
1. C →methyl-C
2. Methyl-C →U
3. U→T
⦁CG → TG 20X plus fréquent que les autres mutation
What are Microsatellite mutations?
répétition mutations
Example:
CA repetition that are very variable between individuals
Can be used to compare cell identity between 2 people (example embryo and mother etc)
What is an SNP?
single nucleotide polymorphism
Change in 1 nucleotide
What are the majority of mutations?
Substitutions mutations which is a small rearrangement type mutatuin (p20)
What is 2. Faux-sens (missense) mutation?
change le codon pour celui codant pour un autre acide amine
What is Non-sens (nonsense) mutation?
change le codon pour un codon stop
Why can a homonyme mutation cause an issue?
Homologue (silencieux): change un codon pour un autre codant pour le même acide aminé
Although the protein produced is exactly the same, some phenotypes are explained due to DNA splicing (but very rare)
Related to DNA épissage
Sels chaotropiques
Methode Isolation de l’ADN
Due to DNA electronegativity ADN: adsorbe sur colonne de
verre/membrane
Hybridation method
On construit une séquence de nucléotides complémentaire à une portion de l’ADN du patient (sonde)
Elle est marquée (fluorescence, radioactivité);
La détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
What can Buvardage Southern used for today?
combine électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation
Permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)
Différentes ADN polymérases and clinical relevance
All polymerases have a rate of error
Based on the type of analysis and specificity we might choose a Polymerase with a lower error rate
PCR-migration: Applications
Insertions et délétions
microsatellites
Example:
Contamination foeto-maternelle
(see page 49, 50 for example)
PCR-digestion: Applications
Works by using an enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique
Can detect:
Mutations ponctuelles récurrentes
(single nucleotide change)
Possible de trouver un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
Based on the lengths of the bands we can see if normal or not (see page 53)
Séquençage Sanger
What is the issue with it?
PCR amplification combined with the use of ddNTPs which do not have an -OH at ribose and are flurescent marked
This leads to chain termination at the given spot at random fragments.
Can detect changes anywhere in the gene, no need to know what we are looking for unlike PCR-digestion.
The machine can read the different lengths and fluorescence and write out the DNA sequence (page 59)
issue:
Ne détecte pas les grandes anomalies grandes deletions
PCR temps réel: essai TaqMan
sonde TaqMan est composée
d’un rapporteur et d’un «quencher»
The repporter is fluerescent, the quencher keeps the reporter from flurescing in solution
When the probe is bound to the DNA, the fluerescence begins
The utility is that we can follow in real time how our PCR reaction is happening
PCR temps réel quantitative
Comme dans la PCR la quantité d’ADN double à chaque cycle
Échantillon 1, seuil atteint après 24 cycles (n)
Échantillon 2, seuil atteint après 25 cycles (n+1)
Puisque le nombre de molécules d’ADN double à chaque cycle, et que le seuil est le
même pour les deux échantillons, il y avait 2X moins d’ADN dans l’échantillon 2
This way we can detect the number of copies for a specific gene
MLPA: Multiplex Ligation Probe Amplification
Sonde en** deux sous-unités** (2 oligonucléotides) qui doivent s’hybrider
côte-à-côte sur l’ADN du patient
Ligation des deux portions de la sonde
Amplification PCR de la sonde fusionnée
Électrophorèse capillaire -> check for number of gene copies
Key thing:
Allows us to check for deletions of copies of exons
ADN foetal circulant
Plasma of the blood can contain DNA from the fetus
In some scenarious we can see Y chromosome in women with a boy
As such, this can help us find if the woman is pregnant with a guy or girl
This becomes important in families pregnant with a boy that have a history of an X recessive issue.
The test can allow us to know if a boy is at risk
le séquençage de nouvelle généraiton (SNG) key points
Possible d’analyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps
Each patient has a molecular code-barre tag
Parallel pmplification of DNA in compartments
What is Exome sequencing?
It is the specific sequencing of ONLY EXONS without introns etc
This uses the séquençage de nouvelle généraiton (SNG)
