Moleculaire diagnostiek Flashcards
Waar moet je rekening meehouden met verschillende technieken? (5)
Specificiteit, snelheid, gevoeligheid, betrouwbaarheid en kosten
Voordat je met RNA werkt moet het…
RNA moet eerst reverse transcript worden naar dsDNA voordat het geanalyseerd wordt
Hoe kun je DNA en RNA verkrijgen
Deze kunnen geisoleerd worden uit histologische coupes omdat de formaline het preserveert
Waarvoor gebruik je interne controles?
Om valse positieve te voorkomen
Waarmee kun je analyse doen?
Spectrofotometer voor zuiverheid, gel electroforese voor grootte, en PCR voor sequencing
Conventiele PCR gebruikt een … met een … systeem, deze is … maar ook … sensitief
Conventiele PCR gebruikt een qualitatieve end-phase detection met een open systeem, deze is goedkoper maar ook minder sensitief
Real-time PCR gebruikt een …. met een … systeem, deze is … maar …
Real-time PCR gebruikt een quantitatieve detection exponential phase met een gesloten systeem maar is wel sensitiever
Waarvoor worden probes gebruikt?
Om aan te tonen of je product geamplificeerd is of niet
Wat is het verschil tussen een probe en SybrGreen?
Een probe is target specifiek terwijl SybrGreen aan elke dsDNA bindt
Waarom wordt de smeltcurve analyse gebruikt
Omdat elke product een bepaalde smelttemperatuur heeft, wat afhangt van de GC content en de lengte
Waarom worden dNTP’s gebruikt?
Om tijdens amplificatie de reactie te stoppen
Wat is een isotherme amplificatie
Amplificatie wat gebeurt bij een constante temperatuur e.g. LAMP, TMA, SDA en NASBA
Waarvoor wordt isotherme amplificatie gebruikt?
Voor snelle diagnostiek omdat het tijd en kostbesparend is sinds er geen denaturatie stap is
Wat is het verschil tussen PCR en dPCR?
dPCR heeft een hogere gevoeligheid en precisie dan de PCR en is een digitale verwerking
Hoe werkt dPCR?
De sample wordt verdund en verdeeld over verschillende nano-reactiekamers, de positieve kamers worden digitaal processed als een output
Wat is FISH en hoe werkt het?
Fluorescence in situ hybridisation, met een fluoroscentiemicroscoop kun je met een probe de target detecteren
Wat zijn enkele nadelen van FISH? (3)
De probe kan aspecifiek binden waardoor je een waas van fluorescentie krijgt, de cellen kunnen zich loslaten en het RNA kan verloren gaan tijdens de voorbehandeling
Hoe werkt directie detectie?
De probe wordt dan direct gekoppeld met de label
Hoe werkt indirect detectie?
De probe wordt met een antilichaam gekoppeld en deze wordt dan gekoppeld met een fluorochroom
Hoe werkt micro-array?
Dan is er een vaste oppervlak waar een heleboel spots zitten die een bepaalde sequentie hebben en gehybridiseerd worden met de DNA/RNA target
Hoe werkt next-generation sequencing?
Door parallel sequencing, dit verloopt sneller
Hoe werkt illumina (bridge amplification)?
Door fluorescentie signalen, het verschil in fluorescentie zorgt voor meer betrouwbaarheid
Hoe werkt pyrosequencing?
Pyrofosfaat komt vrij wat opgespoord wordt d.m.v. van een lichtflits
Hoe werkt ion torrent?
Hier meet je de pH, protonen komen vrij en krijg je een verandering krijgt in pH waardoor je weet welke nucleotide is ingebouwd
Hoe werkt 3rd generation sequencing?
Zonder PCR amplificatie en geen synthese, maar door single molecule sequencing wat aangesloten is aan een computer
