Moleculaire Biologie Flashcards
Melting temperature (Tm)
Temperatuur waarbij 50% van het DNA enkelstrengs is
Optimale melting temperatuur voor PCR
52 - 60 graden
75 - 80 graden (hoog GC-gehalte)
Gewenste toelaatbaar verschil Tm van primerpaar PCR en qPCR
< 5 graden en bij qPCR <1 graden
Methoden om fluorescentie te meten qPCR
SYBR Green of TAQman Probes
SYBRgreen
-bindt a-specifiek aan dsDNA
- smelt-curve mogelijk na amplificatie
Taqman probes
-binden specifiek tussen primerset
- 1 fluorescerend fluorchroom = 1 geamplificeerd product
- geen mogelijkheid tot smelt-curve
Excitatie en emissie SYBRgreen
Excitatie = 488nm
Emissie = 522nm
qPCR baseline
Signaalniveau tijdens eerste cycli (ruis)
Waarom baseline bij qPCR bepalen
- om threshold te bepalen
Threshold qPCR
Waarde wanneer signaalniveau statistisch toeneemt ten opzichte van baseline
Threshold cycle (Ct-waarde) qPCR
Cyclusnummer waarbij fluorescentie meetbaar wordt
Assen standaard curve qPCR
Y-as = Ct-waarde
X-as = DNA-concentratie
Slope/helling standaardcurve qPCR
Richtingscoëfficient (RC) maat voor de effiëntie van de reactie (goede reactie 90-110%
Efficiëntie berekenen standaardcurve qPCR
Efficiëntie = (10(-1/slope)-1) x 100%
Determinatie coëfficiënt R2
Geeft aan hoe goed het model bij de data past (voorspelt)
Doel smelcurve/meltingcurve
- checken primer-dimer artifacten
- checken specificiteit reactie
Primer dimer
Artefact waarbij de twee primers aan elkaar hechten vanwege complementaire basen in de primers
Wat wordt tegen elkaar uitgezet in smelcurve
-ΔF/Δt tegen temperatuur