Módulo 3: Citometria de Fluxo

Question 1

O que é a Citómica?

Answer 1

Análise citométrica de citomas (sistemas celulares, estruturas celulares, etc)

Question 2

O que pode ser analisado pela citómica?

Answer 2

• DNA/RNA
• Funcionalidades celulares: crescimento, viabilidade, morte, diferenciação
• Metabolismo celular

Question 3

A citometria é uma análise qualitativa/quantitativa de …?

Answer 3

Quantitativa de células e/ou sistemas celulares

Question 4

A citometria de fluxo é usada para avaliar clusters celulares ou cell individuais?

Answer 4

Cell individuais

Question 5

Quais são as características da citometria de fluxo?

Answer 5

• Rapidez
• sensibilidade
• medição de vários parâmetro ao mesmo tempo
• medição de cell individuais

Question 6

A citometria de fluxo mede as características … e … de partículas … num fluxo de fluído.

Answer 6

• fisicas
• quimicas
• individuais

Question 7

A citometria de fluxo permite a medição individual da … e da … de luz

(ambos são fenómenos luminosos)

Answer 7

• fluorescência
• dispersão

Question 8

Baseados nas características citométricas, como se chamam os sistemas capazes de separar fisicamente as células em citometria de fluxo?

Answer 8

Cell sorters

Question 9

Quais são as limitações da citometria de fluxo?

Answer 9

• limitada a amostras líquidas
• análise de dados sofisticada

Question 10

As características das medições da citometria de fluxo são fornecidas em forma de …?

Answer 10

Distribuição

Question 11

A maioria das medições de citometria de fluxo utiliza marcadores de que tipo?

Answer 11

Fluorescentes

Question 12

Aplicações citometria de fluxo:

Answer 12

• imunofluorescencia
• Cinética do ciclo celular e da célula
• genética
• biologia molecular
• microbiologia
• oceanografia biológica
• biologia do câncro

Question 13

A análise celular da citometria de fluxo analisa parâmetros como:

Answer 13

• forma
• dimensões
• estrutura
• composição
• (enumeração de cell)

Ex: análise do picoplâncton (não são usados corantes -> analísa-se clorofila e caratenoides) ou corantes fluorescentes para DNA ou proteínas; Caract. mais importante: enumeração

Question 14

Quais são os blocos de construção de uma citómetro de fluxo?

Answer 14

1. sistema de fluídos (fluidics)
2. sistema ótico (optics)
3. sistema eletrónico (eletronics)
   Extra: cell sorters

Question 15

Os sistema ótico inclui: 1)… e 2)…

Answer 15

1. fonte de iluminação
2. filtros que direcionam a luz após interceção com o sistema de fluidos

Question 16

O sistema eletrónico converte a … em … para … e …

Answer 16

luz detetada em sinal
visualização e análise

Question 17

A info recolhida depois de uma análise de citometria de fluxo depende da interação entre … e a … analisada.

Answer 17

luz e partícula

Question 18

Que tipos de câmaras de citometria de fluxo existem?

Answer 18

• básicas: cell de quartzo
• fluxo de amostra emerge para o ar/ambiente
• baseadas em microscópios

Question 19

Qual é a função do sistema de fluídos?

Answer 19

Transportar as partículas (amostra) numa corrente, até ao sistema de iluminação.

Question 20

De que maneira é possível que só uma partícula passe pelo feixe de luz num determinado momento?

A amostra tem que ser sujeita a quê?

Answer 20

• Aplicando uma bainha de fluido (sheath fluid)
• Quando o fluxo se mantém estável

Question 21

A bainha de fluido acelera/desacelera as partículas e mantêm-nas/afasta-as do centro. A este processo chama-se:

Answer 21

• Acelera
• mantêm-nas
• Foco hidrodinâmico

Question 22

A amostra e a bainha de fluido misturam-se?

Answer 22

Nas condições ideiais não!

Question 23

Quais são as condições ideiais para que a bainha de fluxo e a amostra não se misturem?

Answer 23

• diferença grande de densidade
• diferença grande de velocidade
• corrente estável

Question 24

Como caracterizas as velocidades da bainha de fluido e de amostra dentro da flow chamber?

Answer 24

• Velocidade da bainha de fluxo é inferior à da amostra

Question 25

Quais as características ideais do **fluxo** na flow chamber?

Answer 25

**Fluxo menos intenso** -> feixe de amostra estreito -> eventos mais espaçados -> melhor resolução

Question 26

Qual o diâmetro normal do fluxo de amostra?

Answer 26

10 μm

Question 27

Para além de hidrodinâmica, o que pode posicionar as partículas numa única fila?

Answer 27

Acústica

Question 28

A utilização de acústica em citometria de fluxo, constitui aparelhos de medição de alta ...

Answer 28

Precisão

Question 29

As fontes de luz podem ser:

Answer 29

* lasers * arc lamps * LEDs

Question 30

Quais as características dos lasers?

Answer 30

* feixe alta intensidade * luz monocromática * feixe de pequeno tamanho (reduz probabilidade de encontrar mais do que uma cell)

Question 31

Quais as características das Arc Lamps?

Answer 31

* necessitam de filtros óticos para selecionar comprimentos de onda * mais baratos para observar fluorescência forte * não dão sensibilidade suficiente para fluorescência fraca ## Footnote Lâmpadas xénon e mercúrio

Question 32

O sistema luminoso compreende o sistema de ... e o de ...

Answer 32

Excitação e captura

Question 33

Os sistemas de captura da luz consitem em ... e ... que direcionam ... para detetores óticos.

Answer 33

* espelhos e filtros * comprimentos de onda específicos

Question 34

Que fenómenos luminosos acontecem quando um feixe de luz atinge uma partícula | São 6

Answer 34

1. reflexão 2. absorção 3. difração 4. fluorescência 5. emissão 6. dispersão

Question 35

De que depende a dispersão da luz?

Answer 35

Características **físicas** das partículas * dimensões * morfologia * complexidade da superfície

Question 36

Caracteriza Forward-scattered light

Answer 36

* proporcional às dimensões/ superfície da cell * detetada no mesmo sentido que o feixe é emitido

Question 37

Caracteriza Side-scattered light

Answer 37

* proporcional à complexidade/forma da cell * resulta no desvio do percurso do feixe por reflexão e/ou refração * colhida num ângulo de 90º em relação ao feixe inicial

Question 38

Os sinais de dispersão lateral + fluorescência são direcionados para ...

Answer 38

Tubos fotomultiplicadores

Question 39

Os sinais de dispersão frontal são recolhidos por ... e convertidos em ...

Answer 39

fotodiodo ... corrente

Question 40

As medições de dispersão frontal e lateral permitem diferencial cell com base... ## Footnote Que exemplo de cell podes dar?

Answer 40

* dimensões (frontal) * complexidade interna (Lateral) ## Footnote Leucócitos (linfócitos, monócitos, neutrófilos)

Question 41

Para onde são direcionados os sinais luminosos depois de passarem pelas partículas?

Answer 41

Para sistemas de espelhos e filtros óticos

Question 42

Como é otimizada a especificidade de cada detetor para determinados comprimentos de onda?

Answer 42

Através de filtros óticos: Bandpass Filters

Question 43

A banda de comprimentos de onda que chega aos detetores é próxima do pico de ...

Answer 43

emissão do pigmento ## Footnote Um Bandpass filter 500/30 só permite a passagem de luz numa gama próxima dos 500 nm

Question 44

Qual a diferença dos shortpass filters para os longpass?

Answer 44

* **Longpass**: passagem de luz com comprimento de onda **superior ou igual** do referênciado * **Shortpass**: passagem de luz com comprimento de onda **inferior ou igual** ao referenciado ## Footnote Os Bandpass permitem a passagem de comprimentos de onda **superiores e inferiores ao de emissão**

Question 45

O que são beam splitters? ## Footnote Um exemplo de um beam splitter é:

Answer 45

Direcionam diferentes comprimentos de onda para direções diferentes ## Footnote Espelhos dicroicos -> 560 SP transmite comprimentos de onda iguais ou inferiores; os superiores são refletidos em 45º em relação ao de incidência

Question 46

Quantos detetores são necessários para medir dispersão de luz frontal?

Answer 46

1

Question 47

Para ... e dispersão de luz ... são usados fotomultiplicadores.

Answer 47

* fluorescência * dispersão frontal

Question 48

A sensibilidade dos detetores depende do ...

Answer 48

comprimento de onda da luz

Question 49

Os sinais luminosos são convertidos em elétricos através de: ## Footnote Quais os mais sensíveis?

Answer 49

* fotorrecetores * fotodiodos * tubos fotomultiplicadores ## Footnote Fotomultiplicadores (para disperção lateral e fluorecência)

Question 50

Como se forma o pulso elétrico?

Answer 50

1. Partícula passa pelo feixe luminoso 2. desvio da luz ou fluorescência da partícula 3. luz/fotão atinge fotorrecetor 4. conversão em eletrões (proporcional) 5. maior corrente elétrica 6. corrente ampliada e convertida em voltes 7. voltes convertidos em sinal digital

Question 51

O ponto mais elevado do pulso elétrico ocorre quando:

Answer 51

A partícula se encontra no centro do feixe / máximo de luz refletida ou de fluorescência é alcançado

Question 52

O pico do sinal reflete...

Answer 52

a fluorescência total da célula

Question 53

Para exibir dados de um único parâmetro, usa-se um histograma...; para dois dados um histograma ...

Answer 53

univariado bivariado/citograma

Question 54

Um cell sorter, pode separar as células como?

Answer 54

* mecanicamente * aplicação de voltagem ao fluxo