Módulo 2: Citometria de Imagem Flashcards
O que é citometria de imagem?
Obtenção de dados citométricos a partir de imagens de células
Quais são os 4 componentes básicos de Citometria de Imagem?
- Amostra celular
- Marcadores celulares
- Plataformas/equipamento
- Software de análise
Quais são as current trends em citometria de imagem?
- Imaging de alta velocidade
- imaging de alta resolução
- citometria cinética de imagem
- machine learning (AI)
Exemplos de microscópios de fundo claro são:
- Microscópio vertical
- Microscópio invertido
Que componentes estão envolvidos na formação de imagens?
Componentes óticos
* iluminador
* condensador
* amostra
* objetiva
* ocular
* detetor (olho do observador ou câmara)
Para que serve o diafragma de campo?
Determina o tamanho do campo de luz que incidente.
As objetivas do microscópio são responsáveis pela formação de imagem …
primária
As objetivas são responsáveis para determinar a … e a …
- Ampliação
- resolução
As objetivas de menor potência tem aberturas numéricas (NA) maiores/menores.
Menores
As objetivas de menor potência são usadas com óleo?
Normalmente não
Qual é o nº da maior abertura numérica, teoricamente possível apenas com ar?
1
É praticamente impossível que seja maior de 0.95 a seco
A abertura numérica depende de:
- Indice refração entre a lente frontal da objetiva e a amostra
- abertura semicircular da objetiva
O que é abertura numérica?
Capacidade que as objetivas têm de colher luz e resolver detalhes finos a uma distância fixa da objetiva
Quanto menor for a abertura numérica maior/menor é o cone de luz.
Maior
Quanto mais próxima a objetiva estiver da amostra, o ângulo do cone aumenta/diminui, logo NA aumenta/diminui
Ângulo aumenta
NA aumenta também
Como se pode aumentar o número de abertura?
Com meio de imersão (óleo, água, glicerina)
Que propriedade o líquido de imersão deve ter para evitar a degradação da imagem?
Deve ter um indice de refração idêntico ao da lamela de vidro.
Define resolução:
Distância mínima entre dois pontos de modo a que ainda se podem distinguir
Uma das características mais importantes do sistema ótico de um microscópio é a capacidade de:
Resolução
A resolução de um microscópio depende da:
Em que se divide
Abertura numérica total
Abertura numérica objetiva + condensador sub-estágio + comprimento de onda da luz
Quanto maior/menor for a abertura numérica total, maior será a resolução.
Maior NA
Quanto maior/menor for o comprimento de onda da luz, maior é a resolução.
Comprimento de onda menor
A melhor seria UV light!
Qual é o principal fator de perda de fluorescência?
Foto-oxidação
Como se pode retardar a perda de sinal fluorescente?
Adicionando agentes redutores ou necrófagos de ROS:
* N-propil-galato
* Mercaptoetanol
A luz pode constituir citotoxicidade?
Sim, fototoxicidade, devido à irradiação de luz e à presença de oxigénio.
A transferência não radioativa de energia de um fluorocromo para um cromóforo dá-se o nome de:
Transferência de enrgia por ressonância
A microscopia de fluorescência é menos distrutiva que a microscopia …
eletrónica
O que torna a microscopia de fluorescência tão abrangente?
- alta seletividade (marcação)
- grande contraste (próprio microscópio)
Uma estimativa das concentrações locais pode ser feita através de um microscópio …
… de fluorescência de campo largo
De todas as sondas que ligam ao DNA, quais são aquelas que se ligam de forma estequimétrica?
O RNA deve sofrer algum processamento?
- DAPI
- Hoechst
- PI
Sim, hidrolisado, visto que as sondas também se podem ligar a ele (PI tem alta afinidade para RNA) (PI também pode competir com proteínas)
Quais são as limitações da microscopia de fluorescência?
- photobleaching
- fototoxicidade
- resolução espacial limitada
Quais os 3 componentes básicos de microscopia?
- fonte de alimentação
- lentes de aumento
- dispositivo de aquisição de imagem
Para uma boa resolução e qualidade de imagem, os microscópios fluorescentes devem separar … da …
eficientemente, separar a luz excitante da luz fluorescente
Para que serve um filtro de excitação?
Para filtrar o comprimento de onda desejado da gama de comprimentos de onda da luz excitante.
Para que serve o espelho dicróico?
Refletir o comprimento de onda excitante e permitir a passagem do comprimento de onda fluorescente
Quais são as lâmpadas mais comuns em microscopia?
- mercúrio
- Xénon
- lasers
Quais as vantagens de se usar lasers em relação às lâmpadas?
- luz quase monocromática
- estabilidade dos feixes de luz
- capacidade de focalizar feixes de luz
Quais eram as desvantagens de se utilizar lasers?
- custo
- gama reduzida de linhas de emissão (comprimentos de onda)
Que lampadas existem num microscópio de fluorescencia?
- halogéneo: visualização inicial
- mercúrio/xénon: excitante para fluorescencia
Num microscópio de varrimento laser confocal, são necessários filtros de excitação? Porquê?
Não, pois a fonte de luz são lasers que por fornecerem luz monocromática, não necessitam de um filtro de excitação para selecionar o comprimento de onda desejável.
Num microscópio confocal, é necessário filtro de emissão?
Sim, para impedir que a luz excitadora atinja o detetor.
Num confocal, o detetor é substituido por …
… fotomultiplicador
Um microscópio confocal melhora a … e …
resolução axial e lateral
De que forma é que um confocal constroi a imagem a ser analisada?
Pixel a pixel pela recolha de fotões emitidos
O confocal tem a capacidade de obter imagens bem focalizadas de várias profundidades dentro da amostra. Como se chama esse processo?
Seccionamento ótico
Como é que se atinge o seccionamento ótico?
Através de um pequeno orifício antes do detetor que impede a emissão de luz** fora do plano de foco**
Quais as vantagens do confocal em relação ao MO?
- Eliminação do ofuscamento fora de foco
- capacidade de recolher secções óticas em série a partir de amostras espessas
- Reconstrução 3D das amostras analisadas
Quais as desvantagens do confocal?
- apesar de recolher só no plano de foco, gera-se fototoxicidade em toda a amostra
- a profundidade de penetração é limitada pela absorção de energia em camadas mais profundas
Para imagem em 3D, a … é melhor que o confocal
microscopia de fluorescencia multifotónica
Qual a diferença da microscopia de fluorescência multifotônica para o confocal?
- Não necessita de orifício no detetor (o laser excita só no ponto de foco)
A emissão fora do foco é insignificante
A microscopia de fluorescencia multifotónica apresenta a vantagem de … em relação ao confocal.
redução de fotobleaching e fototoxicidade
O facto de se bombardear a amostra com dois fotões faz com que o fenómeno de Stokes…
Seja revertido (anti-stokes): a luz fluorescente tem menor comprimento de onda que a excitante
Como a microscopia de fluorescência multifotónica é mais precisa, podem-se usar comprimentos de onda na gama do … . Isto leva a que a penetração seja mais/menos profunda.
vermelho/infravermelho
profunda
A resolução de um microscópio de fluorescência multifotónica é maior que a de um confocal?
Porquê?
Não! A utilização de luz com comprimento de onda maior (infrared/red) resulta num spot de resolução maior.
O que não der para resolver no confocal, não dá para resolver no multifotónico
Em que consiste o Forster Resonance Energy Transfer (FRET)?
Transferência de energia de um fluorocromo excitado para outra moléc dadora.
Em FRET, a que distância as duas moléculas devem estar para que aconteça este fenómeno?
10 nm
Para que pode ser utilizado o FRET?
- Determinar interações moleculares
- determinar distâncias moleculares
Em FRET, a transferência de energia é radioativa?
Não!
Para além da distância, o FRET depende de:
- sobreposição espetral do espetro de emissão e excitação do dador e aceitador
- orientação relativa do momento dipolo do dador e aceitador
Quais as desvantagens do FRET?
- Limitação ao estudo de complexos proteicos/ proteínas muito grandes
Que aplicações tem o FRET na biologia celular?
- estrutura e conformação de proteínas
- distribuição espacial de proteínas
- qPCR (annealing)
- interação prota-prota
- etc
A combinação de FRET + … permitiu limites de resolução de luz de cerca de ….
microscopia ótica
200 nm
Um nanoescópio utiliza quandos lasers? Para que serve/m?
2
* 1 excitador
* 1 cancelador da fluorescência exceto a de um volume de 1 nm
