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Citometria e Imunologia > Módulo 2: Citometria de Imagem > Flashcards

Módulo 2: Citometria de Imagem Flashcards

1
Q

O que é citometria de imagem?

A

Obtenção de dados citométricos a partir de imagens de células

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Q

Quais são os 4 componentes básicos de Citometria de Imagem?

A
  1. Amostra celular
  2. Marcadores celulares
  3. Plataformas/equipamento
  4. Software de análise
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Q

Quais são as current trends em citometria de imagem?

A
  • Imaging de alta velocidade
  • imaging de alta resolução
  • citometria cinética de imagem
  • machine learning (AI)
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4
Q

Exemplos de microscópios de fundo claro são:

A
  • Microscópio vertical
  • Microscópio invertido
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5
Q

Que componentes estão envolvidos na formação de imagens?

A

Componentes óticos
* iluminador
* condensador
* amostra
* objetiva
* ocular
* detetor (olho do observador ou câmara)

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6
Q

Para que serve o diafragma de campo?

A

Determina o tamanho do campo de luz que incidente.

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7
Q

As objetivas do microscópio são responsáveis pela formação de imagem …

A

primária

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8
Q

As objetivas são responsáveis para determinar a … e a …

A
  • Ampliação
  • resolução
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9
Q

As objetivas de menor potência tem aberturas numéricas (NA) maiores/menores.

A

Menores

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10
Q

As objetivas de menor potência são usadas com óleo?

A

Normalmente não

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11
Q

Qual é o nº da maior abertura numérica, teoricamente possível apenas com ar?

A

1

É praticamente impossível que seja maior de 0.95 a seco

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12
Q

A abertura numérica depende de:

A
  • Indice refração entre a lente frontal da objetiva e a amostra
  • abertura semicircular da objetiva
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13
Q

O que é abertura numérica?

A

Capacidade que as objetivas têm de colher luz e resolver detalhes finos a uma distância fixa da objetiva

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14
Q

Quanto menor for a abertura numérica maior/menor é o cone de luz.

A

Maior

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15
Q

Quanto mais próxima a objetiva estiver da amostra, o ângulo do cone aumenta/diminui, logo NA aumenta/diminui

A

Ângulo aumenta
NA aumenta também

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16
Q

Como se pode aumentar o número de abertura?

A

Com meio de imersão (óleo, água, glicerina)

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17
Q

Que propriedade o líquido de imersão deve ter para evitar a degradação da imagem?

A

Deve ter um indice de refração idêntico ao da lamela de vidro.

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18
Q

Define resolução:

A

Distância mínima entre dois pontos de modo a que ainda se podem distinguir

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19
Q

Uma das características mais importantes do sistema ótico de um microscópio é a capacidade de:

A

Resolução

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20
Q

A resolução de um microscópio depende da:

Em que se divide

A

Abertura numérica total
Abertura numérica objetiva + condensador sub-estágio + comprimento de onda da luz

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21
Q

Quanto maior/menor for a abertura numérica total, maior será a resolução.

A

Maior NA

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22
Q

Quanto maior/menor for o comprimento de onda da luz, maior é a resolução.

A

Comprimento de onda menor

A melhor seria UV light!

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23
Q

Qual é o principal fator de perda de fluorescência?

A

Foto-oxidação

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24
Q

Como se pode retardar a perda de sinal fluorescente?

A

Adicionando agentes redutores ou necrófagos de ROS:
* N-propil-galato
* Mercaptoetanol

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25
Q

A luz pode constituir citotoxicidade?

A

Sim, fototoxicidade, devido à irradiação de luz e à presença de oxigénio.

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26
Q

A transferência não radioativa de energia de um fluorocromo para um cromóforo dá-se o nome de:

A

Transferência de enrgia por ressonância

27
Q

A microscopia de fluorescência é menos distrutiva que a microscopia …

A

eletrónica

28
Q

O que torna a microscopia de fluorescência tão abrangente?

A
  • alta seletividade (marcação)
  • grande contraste (próprio microscópio)
29
Q

Uma estimativa das concentrações locais pode ser feita através de um microscópio …

A

… de fluorescência de campo largo

30
Q

De todas as sondas que ligam ao DNA, quais são aquelas que se ligam de forma estequimétrica?

O RNA deve sofrer algum processamento?

A
  • DAPI
  • Hoechst
  • PI

Sim, hidrolisado, visto que as sondas também se podem ligar a ele (PI tem alta afinidade para RNA) (PI também pode competir com proteínas)

31
Q

Quais são as limitações da microscopia de fluorescência?

A
  • photobleaching
  • fototoxicidade
  • resolução espacial limitada
32
Q

Quais os 3 componentes básicos de microscopia?

A
  • fonte de alimentação
  • lentes de aumento
  • dispositivo de aquisição de imagem
33
Q

Para uma boa resolução e qualidade de imagem, os microscópios fluorescentes devem separar … da …

A

eficientemente, separar a luz excitante da luz fluorescente

34
Q

Para que serve um filtro de excitação?

A

Para filtrar o comprimento de onda desejado da gama de comprimentos de onda da luz excitante.

35
Q

Para que serve o espelho dicróico?

A

Refletir o comprimento de onda excitante e permitir a passagem do comprimento de onda fluorescente

36
Q

Quais são as lâmpadas mais comuns em microscopia?

A
  • mercúrio
  • Xénon
  • lasers
37
Q

Quais as vantagens de se usar lasers em relação às lâmpadas?

A
  • luz quase monocromática
  • estabilidade dos feixes de luz
  • capacidade de focalizar feixes de luz
38
Q

Quais eram as desvantagens de se utilizar lasers?

A
  • custo
  • gama reduzida de linhas de emissão (comprimentos de onda)
39
Q

Que lampadas existem num microscópio de fluorescencia?

A
  • halogéneo: visualização inicial
  • mercúrio/xénon: excitante para fluorescencia
40
Q

Num microscópio de varrimento laser confocal, são necessários filtros de excitação? Porquê?

A

Não, pois a fonte de luz são lasers que por fornecerem luz monocromática, não necessitam de um filtro de excitação para selecionar o comprimento de onda desejável.

41
Q

Num microscópio confocal, é necessário filtro de emissão?

A

Sim, para impedir que a luz excitadora atinja o detetor.

42
Q

Num confocal, o detetor é substituido por …

A

… fotomultiplicador

43
Q

Um microscópio confocal melhora a … e …

A

resolução axial e lateral

44
Q

De que forma é que um confocal constroi a imagem a ser analisada?

A

Pixel a pixel pela recolha de fotões emitidos

45
Q

O confocal tem a capacidade de obter imagens bem focalizadas de várias profundidades dentro da amostra. Como se chama esse processo?

A

Seccionamento ótico

46
Q

Como é que se atinge o seccionamento ótico?

A

Através de um pequeno orifício antes do detetor que impede a emissão de luz** fora do plano de foco**

47
Q

Quais as vantagens do confocal em relação ao MO?

A
  • Eliminação do ofuscamento fora de foco
  • capacidade de recolher secções óticas em série a partir de amostras espessas
  • Reconstrução 3D das amostras analisadas
48
Q

Quais as desvantagens do confocal?

A
  • apesar de recolher só no plano de foco, gera-se fototoxicidade em toda a amostra
  • a profundidade de penetração é limitada pela absorção de energia em camadas mais profundas
49
Q

Para imagem em 3D, a … é melhor que o confocal

A

microscopia de fluorescencia multifotónica

50
Q

Qual a diferença da microscopia de fluorescência multifotônica para o confocal?

A
  • Não necessita de orifício no detetor (o laser excita só no ponto de foco)

A emissão fora do foco é insignificante

51
Q

A microscopia de fluorescencia multifotónica apresenta a vantagem de … em relação ao confocal.

A

redução de fotobleaching e fototoxicidade

52
Q

O facto de se bombardear a amostra com dois fotões faz com que o fenómeno de Stokes…

A

Seja revertido (anti-stokes): a luz fluorescente tem menor comprimento de onda que a excitante

53
Q

Como a microscopia de fluorescência multifotónica é mais precisa, podem-se usar comprimentos de onda na gama do … . Isto leva a que a penetração seja mais/menos profunda.

A

vermelho/infravermelho
profunda

54
Q

A resolução de um microscópio de fluorescência multifotónica é maior que a de um confocal?
Porquê?

A

Não! A utilização de luz com comprimento de onda maior (infrared/red) resulta num spot de resolução maior.
O que não der para resolver no confocal, não dá para resolver no multifotónico

55
Q

Em que consiste o Forster Resonance Energy Transfer (FRET)?

A

Transferência de energia de um fluorocromo excitado para outra moléc dadora.

56
Q

Em FRET, a que distância as duas moléculas devem estar para que aconteça este fenómeno?

A

10 nm

57
Q

Para que pode ser utilizado o FRET?

A
  • Determinar interações moleculares
  • determinar distâncias moleculares
58
Q

Em FRET, a transferência de energia é radioativa?

A

Não!

59
Q

Para além da distância, o FRET depende de:

A
  • sobreposição espetral do espetro de emissão e excitação do dador e aceitador
  • orientação relativa do momento dipolo do dador e aceitador
60
Q

Quais as desvantagens do FRET?

A
  • Limitação ao estudo de complexos proteicos/ proteínas muito grandes
61
Q

Que aplicações tem o FRET na biologia celular?

A
  • estrutura e conformação de proteínas
  • distribuição espacial de proteínas
  • qPCR (annealing)
  • interação prota-prota
  • etc
62
Q

A combinação de FRET + … permitiu limites de resolução de luz de cerca de ….

A

microscopia ótica
200 nm

63
Q

Um nanoescópio utiliza quandos lasers? Para que serve/m?

A

2
* 1 excitador
* 1 cancelador da fluorescência exceto a de um volume de 1 nm

Citometria e Imunologia (5 decks)

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