Módulo 1: Introdução à fluorescência

Question 1

A energia do fotão emitido é sempre mais baixa/alta do que a dos fotões da luz absorvida.

A que fenómeno luminoso está associado?

Answer 1

baixa (maior comprimento de onda)

Fluorescência

Question 2

O que é o espectro de absorção de uma partícula?

Answer 2

É a gama em que um composto pode ser excitado.

Por outro lado, a gama de comprimentos de onda que um composto emite chama-se “espetro de emissão”

Question 3

Em que consiste o desvio de Stokes?

Stokes Shift

Answer 3

A luz fluorescente que um corpo emite é de maior comprimento de onda do que a luz excitante.

Question 4

Um fluorófero com bom desvio de Stokes é menos ou mais fiável?

Answer 4

Mais fiável. Há uma boa separação dos comprimentos de onda excitante e emitida.

Question 5

O espetro de emissão corresponde à transição do eletrão para niveis mais altos/baixo de energia.

Answer 5

Baixos

Question 6

Em fluorescência, o espetro de emissão é a imagem … do espetro de absorção.

Answer 6

Espelho

Só quando há excitação S0 -> S1

Question 7

Dentro das gamas de excitação e emissão, existe um pico (máximo)?

Answer 7

Sim!

Question 8

Quais são as propriedades das moléculas fluorescentes?

Answer 8

• Grande coeficiente de extinção na região de excitação (quantidade de luz absorvida de um determinado comprimento de onda)
• Alto rendimento quântico
• comprimento de onda de excitação ótimo
• Fotoestabilidade
• Vida em estado excitado
• Perturbação mínima pela sonda

Question 9

O que é rendimento quântico?

Answer 9

Razão entre o nº de fotões emitidos e o nº de fotões absorvidos

Question 10

O rendimento quântico depende de alguma coisa?

Answer 10

Sim, do ambiente biológico:
* pH
* oxigenação
* ligação (?)

Question 11

De que depende a intensidade de fluorescência?

Answer 11

• Absorção
• rendimento quântico
• polaridade do solvente
• pH meio aquoso
• proximidade a espécies quencher

Question 12

O que é Fluorescence Quenching?

Answer 12

Quando o rendimento quântico de um fluorófero diminui sem alterar o comprimento de onda de emissão –> Diminuição da intensidade

Question 13

A emissão de corpos autofluorescentes está próxima da gama dos …

Answer 13

Infravermelhos

Question 14

Podemos distinguir a autofluorescência da fluorescência exógena (marcadores)?

Answer 14

Sim!

Question 15

Que identidades celulares/moleculares têm autofluorescência?

Answer 15

• Mitocôndrias
• Lisossomas
• a.a. aromáticos
• lipo-pigmentos
• NADH
• coenzimas flavinóides
• matriz extracelular (colagénio e elastina)

Question 16

A análise da autofluorescência pode ser utilizada para avaliar alterações no estado celular?

Answer 16

Sim!

Estado morfológico e fisiológico de cell e tecidos.

Question 17

A análise da autofluorescência tem a vantagem de:

diz duas vantagens

Answer 17

• ser avaliada em tempo real
• não necessitar de marcadores exógenos

Question 18

GFP (green fluorescent protein) é um cromóforo ou um fluoróforo?

Answer 18

Fluoróforo

Question 19

O que é um cromóforo?

Answer 19

Componentes/partes de moléculas que absorvem luz (dão cor!)

Question 20

A maioria dos cromóforos são …

Answer 20

Aneis aromáticos

Question 21

Os cromóforos fluorescentes usados para marcar moléc. biológicas devem ter valores baixos/elevados de rendimento quântico.

Answer 21

Elevados

Question 22

Que tipos de fluoróforos existem?

Answer 22

• proteínas e péptidos
• compostos orgânicos
• polímeros sintéticos
• sistemas multi componentes
• quantum dots

Question 23

Os fluoróferos biológicos podem ser divididos em … e …

Dá exemplos.

Answer 23

1. endógenos
   * a.a. (triptofano, tirosina…)
   * enzimas e co-enzimas (NADH)
   * Vitaminas (Vit A, K, D)
   * Lípidos
   * Porfirinas
2. exógenos
   * Propidium iodide

Question 24

A maioria dos fluoróforos endógenos requer comprimentos de onda de absorção na gama do ….

Que implicação isso tem?

Answer 24

Ultravioleta

baixo comprimento de onda

Perigo para as células vivas

Question 25

Os fluoróforos endógenos apresentam baixo … e …

Answer 25

brilhos e rendimento quântico

Question 26

O GFP é um fluoróforo endógeno ou exógeno?

Answer 26

Endógeno

Question 27

A GFP tem algumas particularidades. Quais?

Answer 27

• absorção azul -> emissão verde
• cromóforo no centro da proteína
• não tóxico e não evasivo
• pode ser expresso em cell. vivas
• retirado de alforreca
• não necessita de fatores ou substratos para emitir luz verde

Question 28

Que aplicações a GFP tem?

Answer 28

• protein tagging
• monotorizar expressão génica
• biological screens

Question 29

Exemplos generalizados de fluoróferos exogenos são:

Answer 29

• proteínas e péptidos
• pequenos compostos orgânicos
• polímeros sintéticos

Question 30

Um requerimento importante em citometria de fluxo é que o probe usado…

Answer 30

… dê target ao local de interesse das células a ser analisado

Question 31

Como escolher os fluoróforos ideiais?

Answer 31

• pelo mecanismo de ação
• aqueles cuja fluorescencia aumenta após ligação ao local target
• aqueles cuja fluorescência depende de parâmetros fisiológicos (pH, potencial de membrana)
• ” “ atividade enzimática
• fluoróforos que podem ser conjugados

Question 32

O que marcam os seguintes fluoróforos exógenos?
* FICT
* PI
* Nile red

Answer 32

• FICT: proteínas
• PI: ácidos nucléicos
• Nile Red: lípidos

Question 33

Exemplos de marcadores para ácidos nucléicos:

Quais desses são marcadores intercalantes?

Answer 33

• PI
• DAPI
• Hoechst
• Ethidium bromide

Ethidium bromide e PI

Question 34

Tanto o Ethidium Bromide como o PI só passam em células …

Answer 34

Não viáveis (membrana celular comprometida)

Question 35

O PI é usado para avaliar:

Answer 35

• Viabilidade celular (só entra em cell mortas)
• Conteúdos de DNA
• ciclo celular

Question 36

O que acontece à fluorescência dos marcadores quando se ligam a ácidos nucléicos?

Answer 36

Aumenta 20 a 30 vezes!

Question 37

Exemplos de corantes de DNA específicos A-T:

Answer 37

• DAPI
• Hoechst

Question 38

O DAPI consegue entrar em membranas viáveis?

Answer 38

Sim, mas passa por membranas não viáveis de forma mais eficiente

Question 39

Exemplos de marcadores de DNA específicos G-C:

Answer 39

• chromomycin A3

Question 40

Um corante para avaliar o ciclo celular é:

Answer 40

Acridine orange

Question 41

Para marcar proteínas celulares totais pode-se usar:

Answer 41

• Texas red
• FICT
• Ficobiliproteínas

Question 42

O FICT é propenso a:

Answer 42

Photobleaching (perda gradual de intensidade)

Question 43

As ficobiliproteínas são derivadas de moléculas encontradas nas…

Answer 43

Cianobactérias

Question 44

Exemplos de sondas para iões são:

Answer 44

• INDO-1
• FLuo-3

Question 45

Exemplos de marcadores específicos de organelos são:

Answer 45

• BODIPY -> aparelho de Golgi
  Rhodamine 123 -> mitocôndrias (potencial de membrana)

Question 46

O que são Tadem Dyes? Como funcionam?

Answer 46

Dois fluorocromos acoplados.
O primeiro, em vez de fluorescer, transfere energia para o segundo e este por sua vez emite fluorescência.

Question 47

Para que os Tadem Dyes funcionem o espetro de emissão/excitação do 1º deve sobrepor-se ao espetro de emissão/excitação do 2º. Os fluorocromos devem estar muito juntos/afastados.

Answer 47

emissão; Excitação; Juntos

Question 48

Um exemplo de um Tandem Dye é:

Answer 48

FRET

Question 49

O que são Quantum Dots?

Answer 49

• nanopartículas semicondutoras que possuen propriedades optoeletrónicas de tamanho único e dependentes da forma

Question 50

Os quantum dots têm sido utilizados para quê?

Answer 50

Biomedicina: imagem de tecidos em tempo real, diagnóstico, entrega medicamentos

Question 51

Como fonte de luz, o que é mais utilizado para exitar?

Answer 51

Lasers de árgon

Question 52

Podemos usar vários fluorcromos com a mesma gama de excitação desde que…

Answer 52

A gama de emissão seja suficientemente distinta