Módulo 1: Introdução à fluorescência Flashcards
A energia do fotão emitido é sempre mais baixa/alta do que a dos fotões da luz absorvida.
A que fenómeno luminoso está associado?
baixa (maior comprimento de onda)
Fluorescência
O que é o espectro de absorção de uma partícula?
É a gama em que um composto pode ser excitado.
Por outro lado, a gama de comprimentos de onda que um composto emite chama-se “espetro de emissão”
Em que consiste o desvio de Stokes?
Stokes Shift
A luz fluorescente que um corpo emite é de maior comprimento de onda do que a luz excitante.
Um fluorófero com bom desvio de Stokes é menos ou mais fiável?
Mais fiável. Há uma boa separação dos comprimentos de onda excitante e emitida.
O espetro de emissão corresponde à transição do eletrão para niveis mais altos/baixo de energia.
Baixos
Em fluorescência, o espetro de emissão é a imagem … do espetro de absorção.
Espelho
Só quando há excitação S0 -> S1
Dentro das gamas de excitação e emissão, existe um pico (máximo)?
Sim!
Quais são as propriedades das moléculas fluorescentes?
- Grande coeficiente de extinção na região de excitação (quantidade de luz absorvida de um determinado comprimento de onda)
- Alto rendimento quântico
- comprimento de onda de excitação ótimo
- Fotoestabilidade
- Vida em estado excitado
- Perturbação mínima pela sonda
O que é rendimento quântico?
Razão entre o nº de fotões emitidos e o nº de fotões absorvidos
O rendimento quântico depende de alguma coisa?
Sim, do ambiente biológico:
* pH
* oxigenação
* ligação (?)
De que depende a intensidade de fluorescência?
- Absorção
- rendimento quântico
- polaridade do solvente
- pH meio aquoso
- proximidade a espécies quencher
O que é Fluorescence Quenching?
Quando o rendimento quântico de um fluorófero diminui sem alterar o comprimento de onda de emissão –> Diminuição da intensidade
A emissão de corpos autofluorescentes está próxima da gama dos …
Infravermelhos
Podemos distinguir a autofluorescência da fluorescência exógena (marcadores)?
Sim!
Que identidades celulares/moleculares têm autofluorescência?
- Mitocôndrias
- Lisossomas
- a.a. aromáticos
- lipo-pigmentos
- NADH
- coenzimas flavinóides
- matriz extracelular (colagénio e elastina)
A análise da autofluorescência pode ser utilizada para avaliar alterações no estado celular?
Sim!
Estado morfológico e fisiológico de cell e tecidos.
A análise da autofluorescência tem a vantagem de:
diz duas vantagens
- ser avaliada em tempo real
- não necessitar de marcadores exógenos
GFP (green fluorescent protein) é um cromóforo ou um fluoróforo?
Fluoróforo
O que é um cromóforo?
Componentes/partes de moléculas que absorvem luz (dão cor!)
A maioria dos cromóforos são …
Aneis aromáticos
Os cromóforos fluorescentes usados para marcar moléc. biológicas devem ter valores baixos/elevados de rendimento quântico.
Elevados
Que tipos de fluoróforos existem?
- proteínas e péptidos
- compostos orgânicos
- polímeros sintéticos
- sistemas multi componentes
- quantum dots
Os fluoróferos biológicos podem ser divididos em … e …
Dá exemplos.
- endógenos
* a.a. (triptofano, tirosina…)
* enzimas e co-enzimas (NADH)
* Vitaminas (Vit A, K, D)
* Lípidos
* Porfirinas - exógenos
* Propidium iodide
A maioria dos fluoróforos endógenos requer comprimentos de onda de absorção na gama do ….
Que implicação isso tem?
Ultravioleta
baixo comprimento de onda
Perigo para as células vivas
Os fluoróforos endógenos apresentam baixo … e …
brilhos e rendimento quântico
O GFP é um fluoróforo endógeno ou exógeno?
Endógeno
A GFP tem algumas particularidades. Quais?
- absorção azul -> emissão verde
- cromóforo no centro da proteína
- não tóxico e não evasivo
- pode ser expresso em cell. vivas
- retirado de alforreca
- não necessita de fatores ou substratos para emitir luz verde
Que aplicações a GFP tem?
- protein tagging
- monotorizar expressão génica
- biological screens
Exemplos generalizados de fluoróferos exogenos são:
- proteínas e péptidos
- pequenos compostos orgânicos
- polímeros sintéticos
Um requerimento importante em citometria de fluxo é que o probe usado…
… dê target ao local de interesse das células a ser analisado
Como escolher os fluoróforos ideiais?
- pelo mecanismo de ação
- aqueles cuja fluorescencia aumenta após ligação ao local target
- aqueles cuja fluorescência depende de parâmetros fisiológicos (pH, potencial de membrana)
- ” “ atividade enzimática
- fluoróforos que podem ser conjugados
O que marcam os seguintes fluoróforos exógenos?
* FICT
* PI
* Nile red
- FICT: proteínas
- PI: ácidos nucléicos
- Nile Red: lípidos
Exemplos de marcadores para ácidos nucléicos:
Quais desses são marcadores intercalantes?
- PI
- DAPI
- Hoechst
- Ethidium bromide
Ethidium bromide e PI
Tanto o Ethidium Bromide como o PI só passam em células …
Não viáveis (membrana celular comprometida)
O PI é usado para avaliar:
- Viabilidade celular (só entra em cell mortas)
- Conteúdos de DNA
- ciclo celular
O que acontece à fluorescência dos marcadores quando se ligam a ácidos nucléicos?
Aumenta 20 a 30 vezes!
Exemplos de corantes de DNA específicos A-T:
- DAPI
- Hoechst
O DAPI consegue entrar em membranas viáveis?
Sim, mas passa por membranas não viáveis de forma mais eficiente
Exemplos de marcadores de DNA específicos G-C:
- chromomycin A3
Um corante para avaliar o ciclo celular é:
Acridine orange
Para marcar proteínas celulares totais pode-se usar:
- Texas red
- FICT
- Ficobiliproteínas
O FICT é propenso a:
Photobleaching (perda gradual de intensidade)
As ficobiliproteínas são derivadas de moléculas encontradas nas…
Cianobactérias
Exemplos de sondas para iões são:
- INDO-1
- FLuo-3
Exemplos de marcadores específicos de organelos são:
- BODIPY -> aparelho de Golgi
Rhodamine 123 -> mitocôndrias (potencial de membrana)
O que são Tadem Dyes? Como funcionam?
Dois fluorocromos acoplados.
O primeiro, em vez de fluorescer, transfere energia para o segundo e este por sua vez emite fluorescência.
Para que os Tadem Dyes funcionem o espetro de emissão/excitação do 1º deve sobrepor-se ao espetro de emissão/excitação do 2º. Os fluorocromos devem estar muito juntos/afastados.
emissão; Excitação; Juntos
Um exemplo de um Tandem Dye é:
FRET
O que são Quantum Dots?
- nanopartículas semicondutoras que possuen propriedades optoeletrónicas de tamanho único e dependentes da forma
Os quantum dots têm sido utilizados para quê?
Biomedicina: imagem de tecidos em tempo real, diagnóstico, entrega medicamentos
Como fonte de luz, o que é mais utilizado para exitar?
Lasers de árgon
Podemos usar vários fluorcromos com a mesma gama de excitação desde que…
A gama de emissão seja suficientemente distinta
