Microscopie Flashcards
Quelles sont les composantes principales du microscope photonique et leurs fonctions?
Plusieurs systèmes de lentilles dont, en ordre, un:
- Condensateur: Sous le plateau, dirige la lumière vers l’échantillon
- Objectif : Agrandit l’image, plus près de l’échantillon
- Oculaire: Agrandit une deuxième fois l’image, plus près des yeux
Quels sont les facteurs limitants de la microscopie optique?
- Limite de résolution
- Unités: micromètre
- C’est la distance minimale entre deux objets pour pouvoir bien les distinguer. Plus elle est petite, mieux c’est.
- Longueur d’onde: de la lumière éclairant l’échantillon
- NA: ouverture du numérique, indiquée sur l’objectif, NA = nsin(angle)
- n: indice de réfraction du milieu entre la lentille et l’échantillon
- angle: moitié de l’angle de la lum qui entre dans l’objectif
- Contraste
- Capacité à distinguer structure de son environnement, proportionnel à la qté de lum absorbée par structure vs milieu
- Contraste très faible en photonique
Comment améliorer la LR en microscopie photonique?
- Diminuer longueur d’onde
-En allant dans les UV (lum invisible)
MAIS les problèmes avec UV:
-on doit utiliser du quartz, car le verre ne laisse pas passer les UV
-comme ils sont invisibles, il faut faire des transformations optiques à l’image qui diminuent parfois sa qualité
-dangers d’exposition aux UV - Augmenter indice de réfraction
Changer milieu entre échantillon et la lentille, avec de l’huile à immersion (n = 1.56) - Augmenter angle
- Approcher lentille et échantillon ensemble (distance qu’on appelle distance de travail)
Microscope à fond clair
Structures sombres sur fond clair.
Comparer l’efficacité du microscope photonique vs électronique
Comme les longueurs d’onde utilisées sont plus petites celles des électrons que des photons alors
- le grossissement: de 100 à 1000x max pour photoniques, 400 000x max pour électro
- LR: 0.1 micromètre pour photo vs 0.05 nm pour électro
Sinon, les principes physiques sont semblables.
Composition et caractéristiques de la microscopie électronique?
- Systèmes de lentilles
Condensateur, objectif et oculaire
MAIS: Lentilles ne peuvent pas être du verre, mais plutôt magnétiques
- Comme on est à l’ext. du visible (électrons), on doit alors créer numériquement l’image
- Comme la LR est de l’ordre des nm, alors il ne doit avoir absolument aucune vibration
- Très coûteux
Comment améliorer le contraste en microscopie électronique?
Technique d’ombrage
Coloration négative
Cryodécapage
Immuno-localisation cellulaire
Expliquer la technique d’ombrage.
- Vaporisation de métaux avec un angle précis qui recouvre l’échantillon et projette ainsi une ombre.
- On utilise des billes témoins de taille prédéfénie pour comparer les “ombres” (absence de métaux) et déterminer l’élévation des structures.
Bas = éclairé (absence de métaux) Haut = ombre (métaux absorbent électrons)
Si on utilise un négatif alors c’est le contraire:
Bas = ombre
Haut = éclairé
Expliquer la coloration négative.
Utilisation d’acide phosphotungstique qui absorbe les électrons et a tendance à s’accumuler dans les creux.
Creux = sombre Protubérance = claire
On peut ainsi voir le relief et la structure de, par exemple, des virus.
Expliquer le cryodécapage.
- Congélation en utilisant des températures sous les -180 degrés.
- Appliquer une pression latérale avec une lame afin de faire une coupe transversale (fracture aux zones de faiblesse structurale)
Donc, on voit l’intérieur des cellules et les structures
Expliquer l’immuno-localisation cellulaire.
- On utilise les anticorps spécifiques pour chaque protéine/structure
- Coupler anticorps avec billes de fer ou d’or pour pouvoir les détecter, les localiser
Quels sont les 2 grands types de miscroscopie électronique?
À transmission
À balayage
Expliquer la microscopie électronique à transmission.
Les électrons traversent l’échantillon et sont captés par le détecteur sous celui-ci.
Ils montrent des images “par transparence”.
LR plus petite (agrandissement plus grand possible), donc les structures peuvent être fines.
Expliquer la microscopie électronique à balayage.
Les électrons “balaient” la surface, sont réfléchis et captés par le détecteur latéral.
LR plus grand, mais meilleur relief (montrent en 3D)
Expliquer la microscopie confocale à balayage laser et ses applications.
Microscopie photonique.
- Illumination par laser UV seulement dans un plan précis.
- Utilisation de fluorochromes dans les plans horizontal, vertical et temporel (voir l’évolution de la fluorescence)
- Numérisation de l’image: reconstitution informatique
Applications
- Détection d’une structure dans une cellule, un tissu, etc.
- Développement biofilm
- Quantification cellules vivantes vs mortes
Quels sont les deux types de microscopie à balayage de sonde?
À effet tunnel et à force atomique
Quelles sont les deux grandes catégories de microscope et leur différence fondamentale?
Photonique: utilise photons sur échantillon
Électronique: utilise des électrons sur échantillon
Comment calculer l’agrandissement final d’une image?
Agrandissement final = agrandissement de l’objectif x agrandissement de l’oculaire
Par exemple: agrandissement = 10fois x 10fois = 100fois
Comment améliorer le contraste en microscopie photonique? Expliquer.
On utilise des colorants qui demandent d’abord de fixer l’échantillon.
- Fixer: chauffer pour que m-o soient fixés (“cuits”) à la lamelle = m-o morts
- Colorants: on utilise des colorants chargés pour qu’ils se lient avec ce qu’on souhaite observer ou certains hydrophobes pour qu’ils aient de l’affinité avec parties lipidiques
OU
On utilise d’autres types de microscopes, voir autres flashcards.
Qu’est-ce qu’une préparation à l’état frais?
Observation sans que l’on fasse aucune intervention, les m-o n’ont subi aucune alteration
-Donc, on peut observer leur motilité s’ils en ont la capacité ou leur division cellulaire
mais
-contrastes très bas (qu’on peut améliorer)
Quels sont les types de coloration pour augmenter le contraste?
- Simple
- un seul colorant
- coloration uniforme
- souvent le bleu de méthylène (chargé + car membranes bactériennes souvent chargées nég) - Différentielle
- permet de discriminer
- souvent la coloration de Gram, utilisant le violet de cristal
- autre exemple: coloration alcoolo-acido-résistance
- permet de distinguer structures cellulaires (endospores, capsules, flagelles, corps d’inclusion,…)
Expliquer le microscope à fond noir
La différence est dans le condensateur.
-possède un cône opaque avec cône et miroirs, permettant à la lum d’arriver de manière oblique sur l’échantillon
-ce qu’on voit c’est seulement les rayons déviés
donc
-structures claires sur fond noir
Expliquer le microscope à contraste de phase
La différence est dans le condensateur et les objectifs.
- condensateur et objectif contiennent un anneau de phase qui met la lum en phase. Plus la structure est dense plus il y aura un changement de phase, donc plus elle sera perçue intensément
donc: - structure +/- sombres sur fond clair
- permet d’observer structures fines
-image: a un “halo” plus clair autour + on utilise parfois filtres colorés.
Expliquer le microscope à contraste d’interférence différentielle
La différence est dans la lumière utilisée et le condensateur
- utilisation d’une lum polarisée, par un système de filtres dans condensateur
- structure cellulaire fait dévier lum, donne intensités lumineuses différentes
-image: pas d’halo autour de la cellule, donne une impression de 3D
MAIS
-préparations doivent êtres transparentes pour que lum polarisée puisse traverser
Expliquer la microscopie à épifluorescence (fluorescence)
La différence est dans la lumière utilisée.
- utilisation de pigments fluorescents = fluorochromes
- fluorochromes absborbent UV et réemettent une autre longueur d’onde dans le visible
- doit utiliser quartz pour laisser passer UV et filtre bloquant UV pour pas qu’ils ne se rendent à l’observateur
Quelles sont les applications de la microscopie à fluorescence? Expliquer.
- Proportion cellules mortes et vivantes
- fluorochromes vitaux (distinguent cellules mortes des vivantes, car membranes mortes laissent passer les fluorochromes) - Immunofluorescence
- utilisation de la spécificité des anticorps des protéines/organismes
- coupler fluorochrome à anticorps pour le rendre visible (fluo), l’anticorps va s’attacher sur protéine/organisme
- après on incube pour éliminer le reste qui n’a pas été “fixé” (ne s’est pas attaché)
- permet, par exemple, la détection de pathogènes
- image: voir anticorps fluos
- limite: sensibilité des anticorps, certains ont une affinité plus grande, d’autres moins
- Fiches?
Quelles sont les limites de la microscopie électronique?
- Électrons voyagent dans le vide
alors l’intérieur du microscope doit être absolument vide = matériel observé doit être mort - Électrons sont non-pénétrants
- doit faire des coupes très fines - Matériel vivant n’absorbe pas électrons vs environnement
- contraste très faible, donc on doit utiliser la coloration (avec p.ex. des métaux ou de l’acide phosphotungstique)
Quels sont les microscopes développés plus récemment? Expliquer.
- Cryotéléctromicroscopie
- Congélation très rapide sous les 135 degrés, donc solidification de l’eau sans formation de cristaux (vitrification de l’eau) = meilleure conservation des structures
- On utilise la tomographie: image de plusieurs couches et on reconstitue ensuite la structure numériquement = 3D encore plus précis - Microscope confocal à balayage laser
- À balayage de sonde: à effet tunnel
- Mesurer variations dans le champ électronique avec une sonde très fine
- Permet d’observer en milieu aqueux
- Meilleur grossissement 100 millions de fois
- On peut aussi bouger les atomes
- Applications: nanotechnologies,… - À balayage de sonde: à force atomique
- idéal pour échantillons ne conduisant pas bien électricté
- utilise un laser et une sonde très fine
