Microscopie Flashcards
De quoi dépend la résolution?
- Ouverture numérique
- LO de la lumière
Comment diminuer la résolution?
Diminuer la LO ou augmentation de l’ouverture numérique
Quelle est la formule de la résolution?
r = 1.22 × 𝛌/2 ON
Quelle est la résolution de l’oeil humain?
0.2 mm
Quelle est la définition de la résolution?
Qualité ou netteté de l’image : Séparer deux objets étroitement placés sur une image
Quelle LO a la plus grande énergie?
400 nm (violet)
Pourquoi utilise-t-on les LO de 700 nm sachant qu’ils sont de basse énergie?
Bonne pénétration dans les tissus + Visualisation chez vivants sans tuer (basse fréquence = proche de UV = néfaste)
Quels sont les trois milieux utilisés dans la microscopie?
Eau, huile et air
De quoi dépend l’ON?
Indice de réfraction (n) et angle (a)
Quelle est la formule de l’ouverture numérique?
ON = n x sin(a)
Comment est l’ouverture numérique qui permet de recueillir le plus de rayons lumineux?
Grand angle de l’objectif
Un microscope à résolution de 0.5 um permet de voir quelles tailles d’échantillons?
Tout ce qui est plus grand que 0.5 um
Comment augmenter la résolution outre que LO et l’ON?
- LO hors du spectrum
- Modifier patron de diffraction de la lumière
Quelles sont les deux lentilles d’un microscope composé
- Lentille objectif
2. Lentille oculaire
Quel est le rôle du condenseur?
Focaliser la lumière de la source sur l’échantillon
Quel est le rôle de la lentille oculaire?
Ramasse la lumière et magnifie l’image
Quelles sont les limitations de la microscopie en champ clair?
- Marquer parce que transparent
- faible contraste
- résolution faible
Quel est le préalable avant de faire la microscopie en champ clair?
Fixer les échantillons
Peut-on visualiser les cellules vivantes avec le microscope en champ clair?
Non, fixés donc mort
Quels sont les avantages de la microscopie à contraste de phase?
Cellules en culture + pas de coloration nécessaire
Quelles sont les deux limitations de la microscopie à contraste de phase?
Signaux hors focus et pas bonne résolution
Quels sont les avantages de la microscopie en champ sombre?
Cellules vivantes + bon rapport signal/bruit + hybridation in situ
Quelles sont les limitations de la microscopie en champ sombre?
Limité échantillons qui dispersent bien la lumière
Quels sont les avantages de la microscopie à contraste interférentiel?
Cellules vivantes + bon rapport signal/bruit + 3D + bords et contours
Quelle est la limitation de la microscopie à contraste interférentiel?
Un seul plan focal
Quelles sont les différents types de microscopie à fluorescence?
- Microscopie à fluorescence standard
- Microscopie à fluorescence confocale
- Microscopie à deux-photons (multiphotonique)
- Microscopie STED (déplétion par émission stimulée)
De quoi est composé un microscope à fluorescence?
Émetteur à laser
À quoi sert l’émetteur à laser?
Sélectionner une LO précise
Qu’est-ce qu’un fluorophore?
Émission fluorescence après excitation par la lumière
V ou F : la longueur d’onde émise est la même que la longueur d’onde de stimulation
F, différente
V ou F : le fluorophore passe d’un état - énergétique à + énergétique lorsqu’il est excité par un laser
V
Qu’induit l’excitation de la lumière sur les fluorophores?
Augmentation de l’état énergétique
Comment l’émission de la lumière fluorescente se fait-elle?
Excitation -> augmentation de l’état énergétique -> retour état basal -> émission
Pourquoi est-ce que le spectre d’excitation et d’émission sont légèrement décalés?
Perte E
Quels sont les limitations de la microscopie à fluorescence standard?
Photoblanchiment
Phototoxicité
Bruit de fond
Quels sont les avantages de la microscopie à fluorescence standard?
Plusieurs fluorophores en même temps
Rapport signal/bruit
Détection mlc en faible qté
Quel type d’objet est difficilement visualisé avec la microscopie à fluorescence standard?
Objet épais
Quelle technique de microscopie est à utiliser pour un échantillon plus épais?
Microscopie confocale
Que permet le microscope confocal que ne permet pas le microscope à fluorescence standard?
Plusieurs plan focaux (différentes profondeurs)
Plan Z
Avec quelle microscopie peut-on visualiser des structures dendritiques?
Confocale
Quels sont les avantages de la microscopie confocale?
Extrêmement nettes
Échantillons plus épais
Images dans le plan focal
La microscopie confocale permet-elle de visualiser des événements rapides?
Non, processus lent
Quelles sont les limitations de la microscopie confocale?
Illumination à long terme peut causer photobleaching et processus lent rend difficile visu événements rapides
Quelle est la différence entre la microscopie standard et confocale et la microscopie 2-photons?
1 photon vs 2
Qu’est-ce qui caractérise la microscopie 2-photon?
Double de la longueur d’onde nécessaire
Événement rare
Plan focal très étroit
Quelle est la LO d’excitation dans la microscopie 2-photon?
Proche IR
Comment évite-t-on la phototoxicité avec la microscopie 2-photon?
Proche IR = pénètre sans causer de dommage cellulaire
Comment évite-t-on le photobleaching avec la microscopie 2-photon?
Limitation au point focal
Quelle est la relation entre la fluorescence et l’intensité dans l’excitation à 2 photons?
Fluorescence ~ intensité^2
Quel est le principe de la microscopie de l’épuisement d’émission stimulée (STED)?
1 rayon laser : excitation échantillon
1 rayon laser : désactivation fluorophores avoisinants
Super-résolution
Comment est le bruit de fond d’un microscope STED?
Très faible
Peut-on faire la microscopie électronique sur des cellules vivantes?
Non
Qu’utilise la microscopie électronique?
Faisceau de particules d’électrons
Jusqu’à quel grossissement peut aller la ME?
5 millions de fois
Comment est la LO d’un électron par rapport à un photon?
Plus petite
Quelles sont les limitations de la ME?
Cellules fixés (non vivantes)
Artefacts visuels
