Manipulation des gènes endogènes

Question 1

Qu’est-ce qu’un transgène?

Answer 1

construction exogène

Question 2

De quoi est composé une séquence knock-in?

Answer 2

Homology - Replacement - Neo - Homology - TK

Question 3

À quoi servent les parties “homology” dans un knock-in?

Answer 3

Reconnait la séquence du gène -> HR

Question 4

V ou F: Le promoteur dans un transgène est exprimé de façon ubiquitaire seulement ce qui représente la limite de cette technique

Answer 4

F, ou peut être exprimé sélectivement

Question 5

Comment se déroule le clonage d’un transgène?

Answer 5

Plasmide 1 = promoteur
Plasmide 2 = Cassette d’expression d’intérêt + signal STOP
Insertion 1 -> 2 (en avant de la cassette)

Question 6

Comment identifie-t-on les porteurs du transgène après la micro-injection?

Answer 6

Southern

Question 7

Quelle est la limitation du transgène?

Answer 7

Effet positionnel : même promoteur mais populations différentes exprimant le transgène

Question 8

Quel est un problème survenant avec le knock-in au niveau de l’intégrité du génome?

Answer 8

Remplace un gène endogène donc rend cette copie dysfonctionnelle

Question 9

V ou F : Le promoteur utilisé dans un knock-in est un promoteur construit

Answer 9

F, promoteur endogène

Question 10

Qu’est-ce qu’un knock-in?

Answer 10

Insertion d’un nouveau gène à la place d’un autre gène par recombinaison homologue

Question 11

Quelles sont les différences entre un transgène et un knock-in?

Answer 11

(Transgène) mois vs 2 ans (Knock-in)

Promoteur spécifique (Knock-in) vs Effet positionnel (Transgène)

Question 12

Qu’arrive-t-il lorsque la cassette de sélection positive Neo est bien insérée dans le génome?

Answer 12

¢ survivent parce que homologie a fonctionné

Question 13

Qu’arrive-t-il lorsque la cassette de sélection négative TK s’est insérée dans le génome avec le construit?

Answer 13

¢ ne survivent pas parce que signifie que mauvaise homologie

Question 14

Comment sélectionne-t-on les ¢ ayant bien incorporé le knock-in?

Answer 14

Insertion de la cassette de sélection négative TK dans le génome ont mal incorporé le construit knock-in

Question 15

Quelles sont les limitations du knock-in?

Answer 15

1. • de temps
2. Perte d’une allèle
3. Petit insert
4. Faible expression

Question 16

Comment suivre l’évolution d’un type cellulaire?

Answer 16

Marquage sélectif avec knock-in -> Cre/LoxP

Question 17

V ou F : Cre est exprimé seul dans un construit Knock-in

Answer 17

F, avec une allèle reportrice (EGFP)

Question 18

Comment se déroule le marquage sélectif avec Cre/LoxP?

Answer 18

Cre est transcrit -> protéines Cre retire STOP de la cassette loxp-STOP-loxp-EGFP -> transcription EGFP (2 marquages : Cre + EGFP)

Question 19

Comment faire un marquage spécifique dans un temps précis?

Answer 19

1. Cre-ER -> NOYAU
2. NOYAU -> CYTOPLASME
3. Tamoxifen + Cre-ER
4. CYTOPLASME -> NOYAU
5. Cre-ER + Tamoxifen = Délétion ou marquage pop neuronale

Question 20

Comment inactiver un gène à l’aide de Knock-in?

Answer 20

Remplacer un gène d’intérêt par une cassette de sélection (ex. Néo)

Question 21

Pourquoi utiliser un knock-in au lieu d’un knock-out pour inactiver un gène?

Answer 21

éviter une mortalité précoce pcq knock-out ne permet pas perte de fct d’un gène important tardivement

Question 22

Qu’est-ce que la délétion conditionnelle?

Answer 22

Éviter mort précoce

Cre-LoxP : expression de Cre -> expression de EGFP + knock-out du gène d’intérêt

Question 23

Quelle méthode est utilisée pour faire l’édition directe du génome?

Answer 23

CRISPR-Cas9 -> NHEJ et HR

Question 24

Quel est le principe d’un knock-down?

Answer 24

Dégradation de l’ARN avant sa traduction

Question 25

Quelles sont les deux acteurs dans un knock-down et comment se différentie leur expression?

Answer 25

siRNA = expression transitoire
shRNA = expression durable

Question 26

Comment se fait la répression ciblée avec siRNA?

Answer 26

DICER -> siRNA -> DICER + siRNA = RISC -> RISC attaque ARNm -> Dégradation de l’ARNm

Question 27

Qui est plus rapide entre un knock-out et un knock-down?

Answer 27

Knock-down

Question 28

Qui est plus spécifique entre un knock-out et un knock-down?

Answer 28

knock-out

Question 29

Quelle est la forme d’un shRNA?

Answer 29

Sense - Loop - Antisense

Question 30

Quels sont les deux types de shRNA contrôles

Answer 30

• Scramble : sq non spécifique ne reconnaissant aucun gène

- Rescue shRNA resistant : vérifier spécificité de l’effet

Question 31

Quel est le principe du rescue?

Answer 31

Un transgène permet de regagner une fonction si mutée: promoteur du gène muté avec autre gène (le sauveteur)

Question 32

Quelle est la différence entre un Tet-Off et un Tet-On?

Answer 32

Tet-Off = toujours actif -> répression par doxycycline
Tet-On = jamais actif -> activation par doxycycline

Question 33

À quoi sert le Tet-On/Off?

Answer 33

Expression temporelle d’un transgène : activation ou arrêt d’expression

Question 34

Quels sont les limites du knock-out?

Answer 34

Létal + Toutes les ¢

Question 35

Quelle est la limite du CRISPR?

Answer 35

Il n’y a pas de sélection précise du type de recombinaison homologue et favoriser knock-out

Question 36

Quelles sont les méthodes permettant une précision temporelle?

Answer 36

Knock-down
Cre-ER
Tet-On/Off