Manipulation des gènes endogènes Flashcards
Qu’est-ce qu’un transgène?
construction exogène
De quoi est composé une séquence knock-in?
Homology - Replacement - Neo - Homology - TK
À quoi servent les parties “homology” dans un knock-in?
Reconnait la séquence du gène -> HR
V ou F: Le promoteur dans un transgène est exprimé de façon ubiquitaire seulement ce qui représente la limite de cette technique
F, ou peut être exprimé sélectivement
Comment se déroule le clonage d’un transgène?
Plasmide 1 = promoteur
Plasmide 2 = Cassette d’expression d’intérêt + signal STOP
Insertion 1 -> 2 (en avant de la cassette)
Comment identifie-t-on les porteurs du transgène après la micro-injection?
Southern
Quelle est la limitation du transgène?
Effet positionnel : même promoteur mais populations différentes exprimant le transgène
Quel est un problème survenant avec le knock-in au niveau de l’intégrité du génome?
Remplace un gène endogène donc rend cette copie dysfonctionnelle
V ou F : Le promoteur utilisé dans un knock-in est un promoteur construit
F, promoteur endogène
Qu’est-ce qu’un knock-in?
Insertion d’un nouveau gène à la place d’un autre gène par recombinaison homologue
Quelles sont les différences entre un transgène et un knock-in?
(Transgène) mois vs 2 ans (Knock-in)
Promoteur spécifique (Knock-in) vs Effet positionnel (Transgène)
Qu’arrive-t-il lorsque la cassette de sélection positive Neo est bien insérée dans le génome?
¢ survivent parce que homologie a fonctionné
Qu’arrive-t-il lorsque la cassette de sélection négative TK s’est insérée dans le génome avec le construit?
¢ ne survivent pas parce que signifie que mauvaise homologie
Comment sélectionne-t-on les ¢ ayant bien incorporé le knock-in?
Insertion de la cassette de sélection négative TK dans le génome ont mal incorporé le construit knock-in
Quelles sont les limitations du knock-in?
- de temps
- Perte d’une allèle
- Petit insert
- Faible expression
Comment suivre l’évolution d’un type cellulaire?
Marquage sélectif avec knock-in -> Cre/LoxP
V ou F : Cre est exprimé seul dans un construit Knock-in
F, avec une allèle reportrice (EGFP)
Comment se déroule le marquage sélectif avec Cre/LoxP?
Cre est transcrit -> protéines Cre retire STOP de la cassette loxp-STOP-loxp-EGFP -> transcription EGFP (2 marquages : Cre + EGFP)
Comment faire un marquage spécifique dans un temps précis?
- Cre-ER -> NOYAU
- NOYAU -> CYTOPLASME
- Tamoxifen + Cre-ER
- CYTOPLASME -> NOYAU
- Cre-ER + Tamoxifen = Délétion ou marquage pop neuronale
Comment inactiver un gène à l’aide de Knock-in?
Remplacer un gène d’intérêt par une cassette de sélection (ex. Néo)
Pourquoi utiliser un knock-in au lieu d’un knock-out pour inactiver un gène?
éviter une mortalité précoce pcq knock-out ne permet pas perte de fct d’un gène important tardivement
Qu’est-ce que la délétion conditionnelle?
Éviter mort précoce
Cre-LoxP : expression de Cre -> expression de EGFP + knock-out du gène d’intérêt
Quelle méthode est utilisée pour faire l’édition directe du génome?
CRISPR-Cas9 -> NHEJ et HR
Quel est le principe d’un knock-down?
Dégradation de l’ARN avant sa traduction
Quelles sont les deux acteurs dans un knock-down et comment se différentie leur expression?
siRNA = expression transitoire shRNA = expression durable
Comment se fait la répression ciblée avec siRNA?
DICER -> siRNA -> DICER + siRNA = RISC -> RISC attaque ARNm -> Dégradation de l’ARNm
Qui est plus rapide entre un knock-out et un knock-down?
Knock-down
Qui est plus spécifique entre un knock-out et un knock-down?
knock-out
Quelle est la forme d’un shRNA?
Sense - Loop - Antisense
Quels sont les deux types de shRNA contrôles
- Scramble : sq non spécifique ne reconnaissant aucun gène
- Rescue shRNA resistant : vérifier spécificité de l’effet
Quel est le principe du rescue?
Un transgène permet de regagner une fonction si mutée: promoteur du gène muté avec autre gène (le sauveteur)
Quelle est la différence entre un Tet-Off et un Tet-On?
Tet-Off = toujours actif -> répression par doxycycline Tet-On = jamais actif -> activation par doxycycline
À quoi sert le Tet-On/Off?
Expression temporelle d’un transgène : activation ou arrêt d’expression
Quels sont les limites du knock-out?
Létal + Toutes les ¢
Quelle est la limite du CRISPR?
Il n’y a pas de sélection précise du type de recombinaison homologue et favoriser knock-out
Quelles sont les méthodes permettant une précision temporelle?
Knock-down
Cre-ER
Tet-On/Off
