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Méthodes expérimentales > Introduction d'un gène in vivo et in vitro > Flashcards

Introduction d'un gène in vivo et in vitro Flashcards

1
Q

Quelles sont les stratégies pour introduire l’ADN d’un gène dans une cellule?

A

1- Force physique
2- Produits chimiques
3- Vecteurs viraux

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Q

Qu’est-ce que la transfection?

A

Méthode non-virale

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3
Q

Qu’est-ce que la transduction?

A

Introduction par vecteur viral

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4
Q

Quelles sont les trois méthodes physiques?

A

1- Micro-injection
2- Électroporation
3- Biolistique

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Q

Quel est l’inconvénient d’utiliser des méthodes physiques?

A

Endommager les cellules

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6
Q

De quels équipements a-t-on besoin pour la micro-injection?

A

Microscope, micromanipulateur, aiguille de verre

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7
Q

La micro-injection peut-elle être utilisée pour une grande quantité de cellules à étudier?

A

Non, peu de ¢ parce que une seule ¢ injectée à la fois

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8
Q

La micro-injection est surtout utilisée à quelle fin?

A

Produire des souris transgéniques

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9
Q

Peut-on utiliser la micro-injection sur des neurones?

A

Non, fragile et petit

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10
Q

Comment l’ADN pénètre-t-il dans la cellule à l’aide de l’électroporation?

A

Champs électriques -> pores dans membrane -> ADN migre de - à + donc rentre dans la cellule

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11
Q

Comment s’assurer que l’ADN reste dans la cellule?

A

Retrait champ électrique = fermeture des pores = ADN ne peut sortir

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12
Q

V ou F : L’électroporation ne peut être utilisé qu’in vitro

A

F, in vivo aussi

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13
Q

Où injecte-t-on l’ADN in utero?

A

Ventricules de l’embryon

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14
Q

Comment contrôler la localisation de l’introduction de l’ADN avec électroporation?

A

Position des électrodes

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15
Q

Quels sont deux avantages de l’électroporation?

A
  1. Transfecter plusieurs types cellules in vivo et in vitro

2. Faire varier niveau d’expression du gène par force et pattern CE

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16
Q

Quel est le principe de biolistique?

A
  • Augmentation P gaz (Helium)
  • Rupture disque
  • Propulsion balle liée bille d’or/ADN par P libérée
  • Filtre retient balle
  • Bille d’or + ADN non retenus par le filtre
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17
Q

Qu’est-ce qu’il faut bien contrôler dans la biolistique?

A

Contrôle fin de la pression

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18
Q

Comment sont les ¢ transfectées par la biolistique? Qu’est-ce que cela permet?

A

Dispersées; examiner morphologie d’un neurone isolé

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19
Q

La biolistique peut-elle se faire in vivo?

A

Non

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20
Q

Sur quel type de cible peut se faire la biolistique?

A

Tranche de cerveau pcq épaisseur moins endommagement

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21
Q

Quels sont les deux produits chimiques utilisés pour l’introduction de l’ADN?

A

Phosphate de calcium et lipides de transfection

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22
Q

L’introduction d’ADN par méthode chimique se fait-elle in vivo, in vitro ou les deux?

A

In vitro

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23
Q

Comment l’ADN est-elle introduite par méthode chimique?

A
  1. Liposome entoure ADN
  2. Endocytose OU Fusion avec membrane
  3. Liposome dégradé si endocytosé
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24
Q

En combien de temps se fait la transfection par méthode chimique?

A

En moins de 30 min

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25
Q

Les vecteurs viraux peuvent-ils être introduits in vivo? et in vitro?

A

Oui les deux sont possibles

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26
Q

Que perd et que maintient un virus utilisé en laboratoire?

A

Perte de la capacité de multiplication

Maintien du potentiel infectieux

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27
Q

Quelle technique est utile pour une expression à long terme de l’ADN?

A

Vecteur viral

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28
Q

Quels sont trois inconvénients de l’utilisation de vecteurs viraux?

A
  1. Taille limitée de l’ADN pouvant être inséré dans le génome du vecteur
  2. Expression 7 à 14 jours après transduction
  3. Problème de biosécurité
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29
Q

Quels sont les trois types de virus?

A
  1. Adénovirus
  2. AAV
  3. Lentivirus
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30
Q

Dans quelle cellule se fait la co-transfection pour la production de virus?

A

Cellules HEK 293T

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31
Q

Comment produire un virus?

A

Co-transfection de Vecteur viral + Vecteur navette

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32
Q

Comment sont introduits les virus dans les cellules?

A

Protéines de liaisons entourant le virus fusionne avec la membrane -> endocytose -> endosome -> noyau

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33
Q

Quel type de virus peut contenir la plus grosse quantité d’ADN?

A

Adénovirus (7.5 à 30 kb)

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34
Q

L’ADN de l’adénovirus est-il intégré au génome?

A

Non, expression transitoire

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35
Q

Quel virus induit une réponse inflammatoire et la mort cellulaire?

A

Adénovirus

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36
Q

Quelle est la particularité de l’AAV?

A

Naturellement incapable de se multiplier donc besoin virus helper

37
Q

Quel virus est le plus sécuritaire?

A

AAV parce que ne se multiplie pas tout seul

38
Q

Quelles sont les différences entre AAV et adénovirus?

A
  • Intégration ADN dans le génome = expression long terme de AAV vs pas intégration Adénovirus
  • Pas de multiplication AAV vs multiplication Adénovirus
  • Peu de Rx inflammatoire AAV vs Rx inflammatoire + Mort Adénovirus
39
Q

Quel virus a besoin de trois vecteurs?

A

AAV (Helper, navette, viral)

40
Q

Comment est introduit l’AAV?

A
  1. Attache membrane
  2. Endosome
  3. Fuite de l’endosome
  4. Accumulation périnucléaire
  5. Entrée noyau
  6. Perte capside
  7. Conversion sb en db
  8. Épisome ou insertion génome de l’hôte
41
Q

Quel est le seul virus a avoir un génome d’ARN plutôt d’ADN?

A

Lentivirus

42
Q

De quelle famille fait partie le lentivirus?

A

Retrovirus

43
Q

Comment convertir l’ARN du lentivirus en ADN?

A

Transcriptase inverse

44
Q

L’ADN provenant du lentivirus est-il intégré dans le génome de l’hôte?

A

Oui, donc expression à long terme

45
Q

Qu’est-ce qui différentie le lentivirus des autres retrovirus?

A

Capable d’infecter des ¢ mitotiques ET post-mitotiques

46
Q

Combien de vecteurs sont nécessaires pour produire un lentivirus et lesquels?

A
  1. Vecteur navette
  2. Vecteur ADN
  3. Enveloppe (protéines)
47
Q

Quelles sont les méthodes utilisées pour l’introduction d’ADN dans les cultures cellulaires?

A

Électroporation, virus et chimique

48
Q

Quelles sont les méthodes utilisées pour l’introduction d’ADN dans les tranches de cerveau?

A

Virus et biolistique

49
Q

Quelles sont les méthodes utilisées pour l’introduction d’ADN in vivo?

A

Virus et électroporation

50
Q

Quelles sont les avantages d’utiliser la culture cellulaire en dépit du in vivo?

A
  • Plus rapide
  • Moins dispendieux
  • Moins d’animaux requis
  • Plusieurs expériences avec nombre exact de ¢
51
Q

D’où proviennent les cultures cellulaires?

A

¢ isolées de l’animal

52
Q

Quels sont certains avantages de la culture cellulaire?

A
  • Simplification de l’environnement
  • Réduction des intéractions
  • Contrôle conditions d’expérimentation
53
Q

Quels sont les trois types cellulaires utilisés en culture cellulaire?

A
  • Lignées de ¢ immortalisées
  • Culture primaire
  • Cellules souches
54
Q

Comment s’assurer que les conditions de culture sont adéquates pour le maintien en vie des ¢?

A
  • Oxygène, nutriments et facteurs de croissance

- Réactifs pour prévenir contaminations

55
Q

Quel problème peut surgir avec les lignées cellulaires immortalisées?

A

Se divisent indéfiniment (mutations ou anomalies chromosomiques) donc confluence de 100% possible dans les pétris. Il faut donc détacher les ¢ du plastique par trypsine et transférer les cellules dans d’autres pétris.

56
Q

Quel est l’avantage d’utiliser des lignées cellulaires immortalisées par rapport à des cellules primaires?

A

Moins besoin d’animaux et plus facile à cultiver

57
Q

Quelles sont les avantages des lignées cellulaires immortalisées?

A
  • Très bien caractérisées
  • Popu génétiquement identique = reproductible et cst
  • Extraire bcp protéines
  • Expression permanente protéine avec tag fluo
58
Q

Quel est l’inconvénient des lignées cellulaires immortalisées?

A

¢ différentes que les cellules normales (division continuelle = pas naturel), à long terme -> chg fct et mutations

59
Q

Quel est un exemple de lignée cellulaire immortalisée utilisée?

A

Cellules PC12

60
Q

En général, d’où proviennent les cellules immortalisées?

A

tumeurs, neuroblastomes

61
Q

La différentiation des cellules PC12 en neurones est-elle réversible?

A

Oui

62
Q

Qu’est-ce qui induit la différentiation des cellules PC12 en neurones?

A

Ajout de NGF dans le milieu de culture

63
Q

Quels sont les deux inconvénients des cultures primaires?

A
  • Survie limitée

- Influence de l’âge de l’animal

64
Q

Quels sont les types de cultures primaires?

A
  • Cultures dissociées
  • Explants
  • Cultures de tranches de tissu
65
Q

Quel est le principe de cultures de cellules dissociées?

A

Sépare les ¢ individuellement -> suspension homogène

66
Q

Quels sont deux avantages des cellules dissociées?

A
  1. Garde identité région d’où proviennent

2. Neurones individuels

67
Q

Quelles sont les étapes de différenciation dendritique et axonale?

A

Filopodes -> neurite mineure -> axone -> dendrite -> synapse

68
Q

Quelles sont les deux méthodes utilisées pour isoler une population précise dans des cultures de cellules dissociées? Comment sont les cellules suite à ces deux méthodes?

A
  • Immunopanning : Ac
  • Cytométrie de flux
    Cellules en suspension
69
Q

Quels sont deux inconvénients des cellules dissociées?

A
  • Perte organisation + Connections normales

- Petite qté de cellules

70
Q

Quels sont deux avantages des tranches de cerveau?

A
  • Conservation organisation et connections

- Accès structures en profondeur

71
Q

Quelle est la différence entre les tranches aigues et les tranches organotypiques?

A 
aigues = immédiatement
organotypiques = jours-semaines
72
Q

Que nécessite les cultures de tranche?

A

Interface air/liquide pour échange gazeux à travers la tranche

73
Q

Que sont les explants?

A

Préparation intermédiaire entre cellules dissociées et les tranches

74
Q

Quel type de cellules sont les cellules souches?

A

Cellules pluripotentes

75
Q

Quelles sont les deux caractéristiques des cellules pluripotentes?

A
  1. Générer tous les types cellulaires

2. Division illimitée

76
Q

À quels autres types de cultures ressemblent les cultures cellules souches?

A

Lignées cellulaires immortalisées (division continuelle) et les cellules primaires (proviennent animal vivant)

77
Q

Quelles sont les classes de cellules souches?

A
  1. Cellules souches embryonnaires
  2. Cellules souches adultes
  3. Cellules souches pluripotentes induites
78
Q

Que doit contenir le milieu de croissance des cellules souches pour préserver leur capacitée de division illimitée?

A

EGF et bFGF

79
Q

D’où sont dérivées les cellules souches embryonnaires?

A

Cellule de la masse interne du blastocyte

80
Q

Quelles cellules peuvent produire les cellules souches embryonnaires?

A

Toutes les cellules de l’organisme

81
Q

Comment produire des motoneurones à partir de cellules souches embryonnaires?

A

Exposition à Shh et acide rétinoïque

82
Q

Comment produire des neurones dopaminergiques à partir de cellules souches embryonnaires?

A

Exposition à Shh et FGF8

83
Q

Quel est l’inconvénient des cellules souches embryonnaires?

A

Production ¢ souches et différentiation en neurones spécifiques peut prendre des mois

84
Q

En quelles cellules peuvent se différentier les cellules neurales multipotentes?

A

Tous les types de neurones

85
Q

D’où proviennent les cellules souches adultes?

A

Zone sous-granulaire du gyrus denté (hippocampe) et zone sous-ventriculaire (Ventricules latéraux)

86
Q

Que sont les neurosphères?

A

Boules de Cellules souches neurales en division en suspension dans un milieu de culture contenant des facteurs de croissance

87
Q

Que sont les cellules souches pluripotentes induites?

A

Cellules différenciées -> cellules souches

88
Q

Quelle est la conséquence sur une propriété des cellules IPS? Et comment éviter ce changement de propriété?

A

Perte de signature de vieillissement

Conversion directe des fibroblastes en neurones éviter de passer par étape de pluripotence

89
Q

Quelle méthode d’introduction d’ADN permet une expression à long terme de l’ADN introduit.

A

Vecteur viral

Méthodes expérimentales (5 decks)

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