Introduction d'un gène in vivo et in vitro Flashcards
Quelles sont les stratégies pour introduire l’ADN d’un gène dans une cellule?
1- Force physique
2- Produits chimiques
3- Vecteurs viraux
Qu’est-ce que la transfection?
Méthode non-virale
Qu’est-ce que la transduction?
Introduction par vecteur viral
Quelles sont les trois méthodes physiques?
1- Micro-injection
2- Électroporation
3- Biolistique
Quel est l’inconvénient d’utiliser des méthodes physiques?
Endommager les cellules
De quels équipements a-t-on besoin pour la micro-injection?
Microscope, micromanipulateur, aiguille de verre
La micro-injection peut-elle être utilisée pour une grande quantité de cellules à étudier?
Non, peu de ¢ parce que une seule ¢ injectée à la fois
La micro-injection est surtout utilisée à quelle fin?
Produire des souris transgéniques
Peut-on utiliser la micro-injection sur des neurones?
Non, fragile et petit
Comment l’ADN pénètre-t-il dans la cellule à l’aide de l’électroporation?
Champs électriques -> pores dans membrane -> ADN migre de - à + donc rentre dans la cellule
Comment s’assurer que l’ADN reste dans la cellule?
Retrait champ électrique = fermeture des pores = ADN ne peut sortir
V ou F : L’électroporation ne peut être utilisé qu’in vitro
F, in vivo aussi
Où injecte-t-on l’ADN in utero?
Ventricules de l’embryon
Comment contrôler la localisation de l’introduction de l’ADN avec électroporation?
Position des électrodes
Quels sont deux avantages de l’électroporation?
- Transfecter plusieurs types cellules in vivo et in vitro
2. Faire varier niveau d’expression du gène par force et pattern CE
Quel est le principe de biolistique?
- Augmentation P gaz (Helium)
- Rupture disque
- Propulsion balle liée bille d’or/ADN par P libérée
- Filtre retient balle
- Bille d’or + ADN non retenus par le filtre
Qu’est-ce qu’il faut bien contrôler dans la biolistique?
Contrôle fin de la pression
Comment sont les ¢ transfectées par la biolistique? Qu’est-ce que cela permet?
Dispersées; examiner morphologie d’un neurone isolé
La biolistique peut-elle se faire in vivo?
Non
Sur quel type de cible peut se faire la biolistique?
Tranche de cerveau pcq épaisseur moins endommagement
Quels sont les deux produits chimiques utilisés pour l’introduction de l’ADN?
Phosphate de calcium et lipides de transfection
L’introduction d’ADN par méthode chimique se fait-elle in vivo, in vitro ou les deux?
In vitro
Comment l’ADN est-elle introduite par méthode chimique?
- Liposome entoure ADN
- Endocytose OU Fusion avec membrane
- Liposome dégradé si endocytosé
En combien de temps se fait la transfection par méthode chimique?
En moins de 30 min
Les vecteurs viraux peuvent-ils être introduits in vivo? et in vitro?
Oui les deux sont possibles
Que perd et que maintient un virus utilisé en laboratoire?
Perte de la capacité de multiplication
Maintien du potentiel infectieux
Quelle technique est utile pour une expression à long terme de l’ADN?
Vecteur viral
Quels sont trois inconvénients de l’utilisation de vecteurs viraux?
- Taille limitée de l’ADN pouvant être inséré dans le génome du vecteur
- Expression 7 à 14 jours après transduction
- Problème de biosécurité
Quels sont les trois types de virus?
- Adénovirus
- AAV
- Lentivirus
Dans quelle cellule se fait la co-transfection pour la production de virus?
Cellules HEK 293T
Comment produire un virus?
Co-transfection de Vecteur viral + Vecteur navette
Comment sont introduits les virus dans les cellules?
Protéines de liaisons entourant le virus fusionne avec la membrane -> endocytose -> endosome -> noyau
Quel type de virus peut contenir la plus grosse quantité d’ADN?
Adénovirus (7.5 à 30 kb)
L’ADN de l’adénovirus est-il intégré au génome?
Non, expression transitoire
Quel virus induit une réponse inflammatoire et la mort cellulaire?
Adénovirus
Quelle est la particularité de l’AAV?
Naturellement incapable de se multiplier donc besoin virus helper
Quel virus est le plus sécuritaire?
AAV parce que ne se multiplie pas tout seul
Quelles sont les différences entre AAV et adénovirus?
- Intégration ADN dans le génome = expression long terme de AAV vs pas intégration Adénovirus
- Pas de multiplication AAV vs multiplication Adénovirus
- Peu de Rx inflammatoire AAV vs Rx inflammatoire + Mort Adénovirus
Quel virus a besoin de trois vecteurs?
AAV (Helper, navette, viral)
Comment est introduit l’AAV?
- Attache membrane
- Endosome
- Fuite de l’endosome
- Accumulation périnucléaire
- Entrée noyau
- Perte capside
- Conversion sb en db
- Épisome ou insertion génome de l’hôte
Quel est le seul virus a avoir un génome d’ARN plutôt d’ADN?
Lentivirus
De quelle famille fait partie le lentivirus?
Retrovirus
Comment convertir l’ARN du lentivirus en ADN?
Transcriptase inverse
L’ADN provenant du lentivirus est-il intégré dans le génome de l’hôte?
Oui, donc expression à long terme
Qu’est-ce qui différentie le lentivirus des autres retrovirus?
Capable d’infecter des ¢ mitotiques ET post-mitotiques
Combien de vecteurs sont nécessaires pour produire un lentivirus et lesquels?
- Vecteur navette
- Vecteur ADN
- Enveloppe (protéines)
Quelles sont les méthodes utilisées pour l’introduction d’ADN dans les cultures cellulaires?
Électroporation, virus et chimique
Quelles sont les méthodes utilisées pour l’introduction d’ADN dans les tranches de cerveau?
Virus et biolistique
Quelles sont les méthodes utilisées pour l’introduction d’ADN in vivo?
Virus et électroporation
Quelles sont les avantages d’utiliser la culture cellulaire en dépit du in vivo?
- Plus rapide
- Moins dispendieux
- Moins d’animaux requis
- Plusieurs expériences avec nombre exact de ¢
D’où proviennent les cultures cellulaires?
¢ isolées de l’animal
Quels sont certains avantages de la culture cellulaire?
- Simplification de l’environnement
- Réduction des intéractions
- Contrôle conditions d’expérimentation
Quels sont les trois types cellulaires utilisés en culture cellulaire?
- Lignées de ¢ immortalisées
- Culture primaire
- Cellules souches
Comment s’assurer que les conditions de culture sont adéquates pour le maintien en vie des ¢?
- Oxygène, nutriments et facteurs de croissance
- Réactifs pour prévenir contaminations
Quel problème peut surgir avec les lignées cellulaires immortalisées?
Se divisent indéfiniment (mutations ou anomalies chromosomiques) donc confluence de 100% possible dans les pétris. Il faut donc détacher les ¢ du plastique par trypsine et transférer les cellules dans d’autres pétris.
Quel est l’avantage d’utiliser des lignées cellulaires immortalisées par rapport à des cellules primaires?
Moins besoin d’animaux et plus facile à cultiver
Quelles sont les avantages des lignées cellulaires immortalisées?
- Très bien caractérisées
- Popu génétiquement identique = reproductible et cst
- Extraire bcp protéines
- Expression permanente protéine avec tag fluo
Quel est l’inconvénient des lignées cellulaires immortalisées?
¢ différentes que les cellules normales (division continuelle = pas naturel), à long terme -> chg fct et mutations
Quel est un exemple de lignée cellulaire immortalisée utilisée?
Cellules PC12
En général, d’où proviennent les cellules immortalisées?
tumeurs, neuroblastomes
La différentiation des cellules PC12 en neurones est-elle réversible?
Oui
Qu’est-ce qui induit la différentiation des cellules PC12 en neurones?
Ajout de NGF dans le milieu de culture
Quels sont les deux inconvénients des cultures primaires?
- Survie limitée
- Influence de l’âge de l’animal
Quels sont les types de cultures primaires?
- Cultures dissociées
- Explants
- Cultures de tranches de tissu
Quel est le principe de cultures de cellules dissociées?
Sépare les ¢ individuellement -> suspension homogène
Quels sont deux avantages des cellules dissociées?
- Garde identité région d’où proviennent
2. Neurones individuels
Quelles sont les étapes de différenciation dendritique et axonale?
Filopodes -> neurite mineure -> axone -> dendrite -> synapse
Quelles sont les deux méthodes utilisées pour isoler une population précise dans des cultures de cellules dissociées? Comment sont les cellules suite à ces deux méthodes?
- Immunopanning : Ac
- Cytométrie de flux
Cellules en suspension
Quels sont deux inconvénients des cellules dissociées?
- Perte organisation + Connections normales
- Petite qté de cellules
Quels sont deux avantages des tranches de cerveau?
- Conservation organisation et connections
- Accès structures en profondeur
Quelle est la différence entre les tranches aigues et les tranches organotypiques?
aigues = immédiatement organotypiques = jours-semaines
Que nécessite les cultures de tranche?
Interface air/liquide pour échange gazeux à travers la tranche
Que sont les explants?
Préparation intermédiaire entre cellules dissociées et les tranches
Quel type de cellules sont les cellules souches?
Cellules pluripotentes
Quelles sont les deux caractéristiques des cellules pluripotentes?
- Générer tous les types cellulaires
2. Division illimitée
À quels autres types de cultures ressemblent les cultures cellules souches?
Lignées cellulaires immortalisées (division continuelle) et les cellules primaires (proviennent animal vivant)
Quelles sont les classes de cellules souches?
- Cellules souches embryonnaires
- Cellules souches adultes
- Cellules souches pluripotentes induites
Que doit contenir le milieu de croissance des cellules souches pour préserver leur capacitée de division illimitée?
EGF et bFGF
D’où sont dérivées les cellules souches embryonnaires?
Cellule de la masse interne du blastocyte
Quelles cellules peuvent produire les cellules souches embryonnaires?
Toutes les cellules de l’organisme
Comment produire des motoneurones à partir de cellules souches embryonnaires?
Exposition à Shh et acide rétinoïque
Comment produire des neurones dopaminergiques à partir de cellules souches embryonnaires?
Exposition à Shh et FGF8
Quel est l’inconvénient des cellules souches embryonnaires?
Production ¢ souches et différentiation en neurones spécifiques peut prendre des mois
En quelles cellules peuvent se différentier les cellules neurales multipotentes?
Tous les types de neurones
D’où proviennent les cellules souches adultes?
Zone sous-granulaire du gyrus denté (hippocampe) et zone sous-ventriculaire (Ventricules latéraux)
Que sont les neurosphères?
Boules de Cellules souches neurales en division en suspension dans un milieu de culture contenant des facteurs de croissance
Que sont les cellules souches pluripotentes induites?
Cellules différenciées -> cellules souches
Quelle est la conséquence sur une propriété des cellules IPS? Et comment éviter ce changement de propriété?
Perte de signature de vieillissement
Conversion directe des fibroblastes en neurones éviter de passer par étape de pluripotence
Quelle méthode d’introduction d’ADN permet une expression à long terme de l’ADN introduit.
Vecteur viral
