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Méthodes expérimentales > Gènes et protéines/Clonage/ADN recombinant > Flashcards

Gènes et protéines/Clonage/ADN recombinant Flashcards

1
Q

Combien de gènes constitue le génome humain?

A

20 000 à 22 000 gènes

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Q

Combien de transcrits sont obtenus à partir du génome humain?

A

100 000 transcrits

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3
Q

Combien de protéines sont obtenus à partir des transcrits humains?

A

1 000 000 de protéines

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4
Q

À quoi sert le criblage génétique classique?

A

IDENTIFIER les gènes -> phénotype à l’étude

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Q

À quoi sert le criblage génétique inversé?

A

DÉTERMINER les phénotypes à partir d’un gène connu

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6
Q

Quelle est la différence entre le criblage classique et inversé?

A 
Classique = plusieurs gènes
Inverse = 1 gène
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7
Q

V ou F : Le phénotype est connu dans le criblage classique

A

V

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8
Q

V ou F : Le criblage classique sert à générer une hypothèse

A

V

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9
Q

V ou F : La séquence n’est pas connue dans le criblage inversé

A

F

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10
Q

Quelles sont les 6 étapes de l’élaboration d’un criblage classique?

A
  1. Élaborer un test de mesure du phénotype
  2. Mutagenèse
  3. Dépistage du phéno anormal
  4. Test de complémentation
  5. Localisation du gène
  6. Clonage du gène
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11
Q

Quels sont les modes de mutagenèses?

A
  • Chimique
  • Irradiation
  • Insertion
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12
Q

Qu’est-ce que la mutagenèse chimique?

A

Mutations ponctuelles :

  • Non-sens
  • Faux-sens
  • Mutation séquence non-codante
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13
Q

Quel est le désavantage de la mutagenèse chimique?

A

Difficile à cartographier

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14
Q

Quel est l’avantage de la mutagenèse chimique?

A

Plusieurs types de mutations différentes (non-sens, faux-sens, région non-codante)

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15
Q

Qu’est-ce que la mutagenèse par irradiation?

A

Rupture ADNdb :

  • Grande délétions
  • Réarrangements chromosomiques
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16
Q

Que permet l’irradiation et l’insertion qui n’est pas possible dans la mutagenèse chimique?

A

Cartographier la mutation

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17
Q

Quel est le désavantage de l’irradiation?

A

Pas limité à un seul gène (grande mutation)

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18
Q

Qu’est-ce que la mutagenèse par insertion?

A

Gène marqueur :

  • Insertion région codante (sq a.a. perturbée)
  • Insertion région non-codante (épissage/expression perturbée)
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19
Q

V ou F : Le gène marqueur ne peut s’insérer que dans une région codante

A

F, région non-codante aussi et induire perturbation de l’épissage p.ex.

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20
Q

Qu’est-ce qui fait en sortes qu’une mutation par insertion est facile à cartographier?

A

Transposon tag est retraçable

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21
Q

Quelle est l’étape 3 du criblage classique est qu’implique-t-elle?

A

Dépistage du phénotype anormal par la production de 100 à 1000 lignées puis test phénotypique (étape 1) pour garder seulement les lignées exprimant le phénotype voulue

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22
Q

Comment déterminer si les mutations identifiées sont uniques ou non? Comment se nomme cette étape?

A

Par des croisements : Si 2 gènes différents alors disparition du phénotype
—–> Test de complémentation

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23
Q

Pour localiser le gène, quels sont les deux techniques utilisées?

A 
Analyse de liaison :
- Chimique
- Irradiation 
Séquence du transposon :
- Insertion
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24
Q

Quelles sont les deux façons de perturber un gène dans le criblage génétique inversé?

A
  1. Knock-out

2. Édition du génome (Knock-in)

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25
Q

Quelles sont les trois méthodes d’édition du génome?

A
  1. CRISPR/Cas9
  2. TALEN
  3. Zinc Finger
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26
Q

Qui entre les knock-outs et les knock-ins sont plus facile à faire?

A

Knock-out

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27
Q

Quel type de knock est favorisé?

A

Knock-out

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28
Q

Quelle étape est commune entre les knock-in et out?

A

PAM -> séquence liaison des nucléases -> clivage de l’ADN -> réparation (NHEJ pour out et HR pour in)

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29
Q

Quelle est la différence entre la réparation des knock-in et des knock-out?

A

in : HR

out : NHEJ

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30
Q

Qu’induit la réparation HR au niveau des sq d’ADN? Cela induit quel type de knocking?

A

Insertion = Knock-in

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31
Q

Qu’induit la réparation NHEJ au niveau des sq d’ADN? Cela induit quel type de knocking?

A

Délétion = Knock-out

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32
Q

Que faut-il ajouter de plus pour avoir un knock-in? Que contient cet élément?

A

ARN guide : mutation à introduire + mutation silencieuse qui perturbe PAM -> éviter cycle de clivage recommence

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33
Q

Quelle est l’inconvénient de l’édition du génome?

A

Off target (clivage plusieurs endroits dans le génome)

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34
Q

Quel est l’inconvénient d’utiliser des marqueurs microsatellites?

A

Couverture non homogène dans le génome : région concentrée en microsatellites et autres avec rien

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35
Q

Quel est l’avantage d’utiliser des marqueurs microsatellites?

A

Très polymorphique : variation entre individu mais dans mm famille pareil

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36
Q

Quelle est la différence entre les micropuces SNPs et les marqueurs microsatellites?

A

Polymorphisme

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37
Q

Quel test est utilisé pour les maladies rares?

A

Analyse de liaison

38
Q

Quel test est utilisé pour les maladies complexes?

A

Études d’association

39
Q

Quels tests se font sur de grandes familles?

A

Analyse de liaison et Études d’association

40
Q

Sous quelle forme se traduit les résultats d’une analyse de liaison?

41
Q

Une étude d’association (GWAS) recherche quoi et entre qui?

A

SNPs groupe contrôle vs groupe malade

42
Q

Le séquençage de l’exome se fait sur quelle partie du génome?

A

Région codante = exons

43
Q

Quel est l’inconvénient du séquençage de l’exome?

A

2% génome seulement -> délaisser introns

44
Q

Qu’est-ce que le séquençage du génome et de l’exome permettent d’identifier?

A

Les variants dans les sq

45
Q

Qu’est-ce qu’un criblage in silico?

A

Approche bio-informatique pour identifier gènes ou protéines

46
Q

Quels sont les trois types de base de données utilisées en criblage in silico?

A
  • BLAST
  • Ensembl
  • UCSC
47
Q

Quelles sont les deux techniques de criblage moléculaire?

A
  1. Micro-puce ADNc

2. Séquençage de l’ARN

48
Q

Quels sont les trois types d’isolation d’ARN dans le séquençage de l’ARN?

A
  1. Poly-A selection : ARNm slmnt
  2. Ribo-depletion : perte ARNr
  3. Size selection : micro ARN
49
Q

À quoi sert le PCR?

A

Amplification

50
Q

Quels sous les trois sous-types de PCR?

A

Standard : ADN à ADN
RT-PCR : ARNm à ADNc
qRT-PCR : analyse quantitative

51
Q

Quels sont les deux techniques de RT-PCR quantitatif?

A

Taqman et Fluorescent SYBR I

52
Q

Quelle est la différence entre TaqMan et SYBR I ?

A

Spécificité (TaqMan)

53
Q

Quelle est la différence entre un vecteur de clonage et un vecteur d’expression?

A

Expression de l’ADN absente dans v. clonage (les deux répliquent l’ADN)

54
Q

Quelles sont deux techniques de purification de l’ADN?

A

Électrophorèse sur gel et Purification chimique

55
Q

Quels sont les types de kits dans la purification chimique?

A
  • Mini-prep
  • Midi-prep
  • Maxi-prep
56
Q

Qu’est-ce que le séquençage de type Sanger?

A

Synthèse de toutes les compositions possible de longueur de fragment -> migration par poids -> reconstruction séquence ADN

57
Q

Comment se fait un clonage?

A

voir diapo 49

  1. Isolation matériel génétique
  2. Amplification (PCR)
  3. Ligation
  4. Transformation
  5. Purification/Isolation (Électrophorèse ou chimique)
  6. Séquençage (Sanger)
58
Q

D’où proviennent les anticorps monoclonaux?

A

Des ¢ B de la rate

59
Q

Comment se nomme les myélomes fusionnés avec l’anticorps?

A

Hybridomes

60
Q

De quoi se sert-on pour produire des anticorps polyclonaux?

A

Système immunitaire de l’animal

61
Q

La production de quel type d’Ac est la plus rapide?

A

Polyclonaux

62
Q

Quelles sont les deux méthodes de purification des protéines?

A

Chromatographie et Immunoprécipitation

63
Q

Quel est le principe de la chromatographie?

A

séparer les protéines sur une colonne (charge, taille, hydrophobicité)

64
Q

Quel est le principe de l’immunoprécipitation?

A

Utilisation d’Ac pour purifier protéine d’intérêt

65
Q

Quelles sont les méthodes pour mesurer l’expression des protéines?

A
  • Western Blot
  • ELISA
  • Radioimmunoassay
  • Immunohistochimie
  • Immunomicroscopie électronique
66
Q

Quelle est la différence entre l’électrophorèse sur gel et le western blot?

A
  1. ADN vs protéines

2. Type de gel : polyacrylamide (protéines) et Bromure d’ethidium (ADN)

67
Q

Quel est le rôle du SDS-PAGE?

A

Dénaturation des protéines

68
Q

Les protéines migrent en fonction de deux composantes, lesquelles?

A

Poids et charge

69
Q

Comment visualise-t-on les protéines sur Western Blot?

A

Ac primaire et secondaire

70
Q

Quelles sont les avantages d’ELISA par rapport à WB?

A
  1. Pas besoin de dénaturation
  2. Quantification plus précise
  3. Quantifier des ng (ELISA) vs µg (WB)
71
Q

Quel est le désavantage d’ELISA par rapport à WB?

A

Ne distingue pas les isoformes -> signal total seulement

72
Q

Quel est le principe de la radioimmunoassay?

A

Ratio protéines liées : non liées

73
Q

D’où proviennent les échantillons de la radioimmunoassay?

A

Sang, LCR et liquide extracellulaire

74
Q

L’immunohistochimie permet-elle une mesure quantitative de l’expression des protéines?

A

Non, visualisation dans l’espace

75
Q

Comment mesurer l’interaction protéine-protéine?

A

Co-immunoprecipitation

76
Q

Quelle technique est utilisée lorsque les protéines sont connues dans la co-immunoprecipitation?

A

WB et SDS-PAGE

77
Q

Quelle technique est utilisée lorsque les protéines ne sont pas connues dans la co-immunoprecipitation?

A

Spectrométrie de masse

78
Q

Quel est le principe de la spectrométrie de masse?

A

Reconnaît les peptides -> ratio MASSE : CHARGE et comparaison avec base de données

79
Q

Quel est le principe du test de mobilité électrophorétique (EMSA)?

A

Interaction ADN et protéines -> bandes plus haut sur électrophorèse

80
Q

Est-ce que EMSA est quantitatif?

81
Q

Quels sont les contrôles utilisés dans l’IP chromatine?

A
  1. Input
  2. Liaison ADN-protéine connue
  3. Ac non-spécifique
  4. Amorces non-spécifiques
82
Q

Quel est le désavantage de l’IP chromatine?

A

Pas savoir si Protéine agit en complexe ou directement avec ADN

83
Q

Sur quel type de matériel de départ se fait l’IP chromatine?

A

Cellules vivantes

84
Q

Quelles sont les trois méthodes de mesure de l’interaction protéine-ADN?

A
  1. IP chromatine
  2. EMSA
  3. Essai luciférase
85
Q

Quel est le principe de ChIP-seq?

A

Séquençage de l’ADN libéré + Comparaison avec banque de données

86
Q

À quoi sert l’essai luciférase?

A

Activation ou répression expression gène par une protéine

87
Q

Quel caractéristique utilise l’essai luciférase?

A

Bioluminescence

88
Q

L’essai luciférase est-il quantitatif?

89
Q

V ou F : On utilise le promoteur de la luciférase

A

F, promoteur de la région d’intérêt

90
Q

Comment détecter des modif post-trad?

A

Anticorps reconnaissant protéine normale vs Ac reconnaissant protéine avec modif post-trad

Méthodes expérimentales (5 decks)

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