MÉTHODES D'ÉTUDES DE LA CELLULE Flashcards
Définition épaisseur
épaisseur de l’échantillon observé
Épaisseur pour un microscope optique
fine
Définition grossisement
rapport théorique entre les dimensions d’un objet vu à l’oeil nu et à travers un instrument
Formule grossissement d’un appareil
produit des grossissement de chaque élément de l’appareil : xn
Définition grossissement utile
grossissement qui permet à l’oeil de distinguer tous les détails les plus fins distinctement
Observation via le microscope
par transparence
Observation via la loupe binoculaire
par lumière réfléchie (= objets opaques)
Définition profondeur de champ
zone comprise entre le premier et le dernier plan net de l’image
Profondeur de champ faible
image proche, fort grossissement
Définition résolution
distance la plus petite entre 2 points d’un échantillon pour qu’ils puissent être distingués
Résolution pour l’oeil humain
75 um pour des objets observés à 25m
Résolution pour une loupe binoculaire
2um
Facteurs faisant varier la résolution pour l’oeil humain
- âge
- contraste de la scène
Formule résolution
R = 0,61 x (λ/n.sin α)
n: plus petit indice de réfraction du trajet optique
α : demi-angle d’ouverture de la lentille
Définition limite de résolution
distance la plus petite entre 2 objets pour qu’ils puissent être distingués dans les meilleures conditions
Comment évolue la résolution
Elle s’améliore avec une petite longueur d’onde et une petite limite de résolution
Comparaison microscopes électroniques et photoniques
ME > MP car λe < λp
Comment s’appelle(nt) le(s) composé(s) servant à contrôler le diamètre de la zone éclairée
- le condenseur
- le diaphragme
Type(s) de microscope(s) photoniques
- microscopes par transmission
- microscope à lumière polarisée/à fond noir/ à contraste de phase
- microscope confocal à balayage
Microscopes par transmission
- observation directe de structure
- jusqu’à 0,2 um
Microscopes à lumière polarisée
informations indirectes sur l’ultra structure des cellules
Microscope confocal à balayage
images 3D grâce à l’utilisation d’un laser comme source lumineuse
Type de lumière utilisée par les microscopes photoniques
lumière visible (390 à 760 nm)
Longueurs d’ondes des ultraviolets et infrarouges
- ultraviolet : <390nm
- infrarouge : >760nm
Loupe binoculaire
- observation de deux façons : lumière réfléchie ou transparence
- limite de résolution de 2um
- grossissement utile de x200
Microscope photonique classique
- observation en transparence
- échantillon de faible épaisseur (<10um)
- limite de résolution de 0,2 um
- grossissement utile de x40 à x1250
Ordre de diffusion de l’image
lampe > préparation > objectif > oculaire > oeil
Grossissement objectif
entre 4 et 100
Grossissement oculaires
entre 10 et 12,5
Grossissement total
entre 40 et 1250
Objectif à immersion
la lentille baigne dans un liquide ayant un indice de réfraction proche de celui du verre, améliorant ainsi la résolution
L’oeil voit une image :
virtuelle, agrandie et renversée (VAR)
Microscope photonique inversé
- objectif en bas, lumière en haut
- permet d’observer les cellules en culture
- observation par transparence
- limite de résolution : 0,2um
- grossissement utile : x40 à x1250
Microscope confocal
- éclairage par balayage laser
- utilisable en fluoescence
- permet une reconstitution 3D
- améliore la résolution
Caractéristiques matériel biologique
- transparent
- réfringent
- peu visible à l’état frais
Objectif microscopie en contraste de phase
observer des cellules sans préparation ou coloration particulière
(principalement cellules vivantes)
Principe microscopie en contraste de phase
sélectionner la lumière déviée par un matériel réfringent à l’aide de deux anneaux appariés :
- un sur le condenseur (=clair)
- un dans l’objectif (=sombre)
L’ensemble ne laisse passer que la lumière réfractée
Principe contraste interférentiel
- création d’interférences lumineuses en lumière polarisée => lumière directe réduite, lumière traversant l’objet transmise
- faisceau lumineux dédoublé puis recomposé
- très bonne qualité
Principe fond noir
- blocage de la lumière source par le condenseur
- observation de la lumière déviée et diffusée par l’objet
=> bactériologie
Définition polarisation
propriété qui consiste à orienter le plan de vibration de la lumière
Principe polarisation
- placement de l’échantillon entre un analyseur et un polariseur
- détection des variations de polarisation après que la lumière ai traversé l’échantillon
- permet de visualiser les structures biréfringentes ou polarisantes
- utilisé en minéralogie
Définition polariseur
2 lames polarisantes
Transmission totale
analyseur et polariseur parallèles => toute la lumière passe
Extinction totale
analyseur et polariseur perpendiculaires => aucune lumière ne passe
Définition fluorescence
propriété qu’ont certaines molécules d’émettre des photons d’énergie plus faible (= λ ++) que les photons de la lumière incidente du microscope
Auto-fluorescent
émet de la fluorescence par lui même
Fluorescence secondaire
combiné avec un fluororchrome
Principe épifluorescence
- lumière excitatrice sélectionnée par des filtres colorés
- dirigée sur l’objet à travers l’objectif par un miroir semi-transparent
- recueillement de la lumière fluo par l’objectif
- retraverser le miroir et des filtres colorées
- forme une image dans l’oculaire
Principe combinaison
combinaison de plusieurs méthodes pour améliorer la précision
Etapes de préparation pour les cellules
- étalement
- fixation
- coloration
Etapes de préparation pour les tissus biologiques
- fixation
- inclusion
- coupe
- coloration
Objectif(s) fixation
- préserver les structures
- durcir les pièces
Défaut fixation
Provoque une mort cellulaire, arrête les réactions biologiques et fige le matériel
Type(s) de fixateurs
- fixateurs coagulants
- fixateurs additifs
Fixateurs coagulants
- solvants organiques
- entraine une coagulation des protéines
- alcools et acides (= protéines nucléaires ++)
Fixateurs additifs
- provoquent des pontages chimiques entre les protéines
- acide picrique ; aldéhydes ; tétrode d’osmium (= lipides +)
Préparations les plus utilisées
- formol tamponné
- liquide de Bouin
- carnoy
Formol Tamponné
- immersion dans le formol
- rinçage avec un tampon
Liquide de Bouin
- jaune
- constitué d’acide picrique, de formol, d’acide acétique
Carnoy
constitué d’acide acétique et de méthanol
Étapes inclusion en paraffine
on plonge le tissu dans :
- l’eau (lavage)
- des bains d’alcool de concentrations croissantes (déshydratation)
- un solvant organique (enlever l’alcool)
- de la paraffine liquide chauffée à 56°
on laisse refroidir
se conserve longtemps
LONG
Objectif inclusion en paraffine
- réaliser un bloc que l’on pourra couper en tranches
Etapes coupe
- fondre légèrement
- tissus minéraux décalcifiés avec un acide faible
- découpage avec un microtome
Objectif coloration
accentuer le contraste pour mieux visualiser les différents éléments
Étapes coloration
- 2 bains de Toluène (suppression paraffine)
- bains d’alcool de concentration décroissante (réhydratation)
- bain de colorant en solution aqueuse
- rinçage à l’eau
=> association de 2 ou 3 colorants
Etapes montage
- bains d’alcool de concentration croissante (déshydratation)
- bains de toluène x2
- dépôt d’une résine liquide hydrophobe (même indice de réfraction que le verre) entre la lame et la lamelle
Objectif(s) résine hydrophobe
- tenir en place
- protéger le matériel
- conserver les préparations colorées
- améliorer la visibilité
Avantages coupe en paraffine
- conservation des structures
- qualité des images très bonne
Inconvénients coupe en paraffine
- lent (36h à 48h)
- petites molécules libres dissoutes
- fixation doit être immédiate
- lipides dissous
- arrêt des activités biologiques
- modification de la conformation des cellules
Principe coupe en congélation
- coupe de tissus congelés à laide d’un cryo-microtomes
- coloration rapide
Avantages coupe en congélation
- rapide
- permet l’examen extemporané
- maintien l’activité biochimique
- met en évidence les molécules non observables en histologie classique
Inconvénients coupe en congélation
- qualité médiocre
- aucune conservation
Principe colorations vitales
peuvent se faire sur des tissus dont les cellules sont vivantes
Type(s) de colorant(s) vital(aux)
- colorants phagocytés (ex. encore de chine) => cellules mononucléées
- colorant diffusant à travers la membrane (ex. bleu de nil)
- colorants pour cellules morte par perméabilité membranaire (ex. éosine-nigrosine)
Définition métachromasie
propriété d’un colorant à changer de couleur en fonction du pH des molécules sur lesquelles il s’est fixé (ex. bleu de toluidine)
Type(s) de colorant(s) général(aux)
- colorants acides
- colorants basiques
Colorants acides
- se fixent sur les molécules basiques/structures acidophiles (ex. protéines cytoplasmiques)
- colorants anioniques
- ex. éosine
Colorants basiques
- se fixent sur les molécules acides/ tissus basophils (ex. acides nucléiques)
- cation colorant
-ex. bleu de toluidine
Colorant(s) utilisé(s) pour les coupes
- hématéine
- érythrosine
- hématéine - éosine (HE)
- safran
- hématéine-érythrosine-safran (HES)
Colorant(s) utilisé(s) pour les frottis sanguins
- May Grünwald-Giema (MGG)
=> cytoplasme en bleu, noyau en pourpre
Principe colorations histochimiques
mettre en évidence in situ les différents constituants (ex. protéines, glucides, acides nucléiques, métaux, etc)
Exemples de colorations histochimiques
- technique du PAS
- technique de Feulgen-Rosenbeck
- colorations argentiques
- coloration de Perl’s
Technique du PAS
- Periodic Acid Schiff
- mets en évidence les sucres complexes grâce à la fuschine
Technique de Feulgen-Rosenbeck
- met en évidence l’ADN
- dosage par photométrie
- coloration proportionnelle à la quantité d’ADN
Colorations Argentiques
- mettent en évidence la mélanine, les amines biogènes et les neurofibrilles
Coloration perl’s
met en évidence le fer
Objectifs histo-enzymologie
- rechercher une activité enzymatique
- mettre en évidence la présence d’enzymes (peroxydases, phosphatases, estérases, etc)
Principe histo-enzymologie
- matériel frais ou congelé
- ajout d’un substrat : si on obtient un produit après incubation, il y a une activité enzymatique
Objectif immuno-histochimie
localiser des protéines dans une cellule
Principe immuno-histochimie
- utilisation d’anticorps de la famille des immunoglobulines qui réagissent à des antigènes et ont une liaison très spécifiques avec les protéines
- marquage par immunofluorescence (directe et indirecte)
Anticorps polyclonaux
- se fixent sur tous les épitopes d’un antigène
- récupérés dans le sérum d’un animal immunisé
Anticorps monoclonaux
- se fixent sur un seul épitope
- produits in vitro à partir d’un clone de plasmocyte animal puis fusionné à une cellule (type lymphocyte tumoral)
Lymphocyte tumoral
production d’anticorps sans limite
Immunofluorescence directe
anticorps couplé à une molécule fluorescente
Immunofluorescence indirecte
- utilisation d’un anticorps secondaire couplé à une molécule fluorescente
- fixation à l’anticorps primaire
=> marquages multiples
Objectif hybridation In Situ
mise en évidence de séquences définies d’ADN ou d’ARN
