Introduction et microscopie électronique Flashcards
Définition biologie cellulaire
sciences des lois qui régissent les phénomènes communs aux différents types de cellules
But biologie cellulaire
préciser les liens entre structure et fonction de ce qu’on observe au microscope
De quoi est constitué un individu de 70kg ?
10^13 cellules et 10^14 bactéries
De quoi est constitué une cellule ?
- de 3.10^9 paires de bases
- d’un ADN qui sera transcrit en ARNm puis traduit en protéines
Combien de gènes s’expriment ?
30 000 à 40 000
Quel est l’élément de fonctionnalité du génome ?
la protéine
Combien existe-t-il de protéines différentes ?
10 à 20 millions
Citez les étapes ayant permis d’arriver à 10^13 cellules
- fécondation d’une cellule donnant une cellule-oeuf puis une cellule diploïde
- multiplication et différenciation par cycles cellulaires et apoptoses
Définition cellule
- unité structurale et fonctionnelle du vivant
- organisme dynamique pouvant produire certaines substances qui vint influencer l’organisme
Caractéristiques cellule
- possède sa propre homéostasie
- doit répondre aux besoins de l’organisme et être réceptive
- capable de se reproduire
Définition homéostasie
capacité d’un système à maintenir l’équilibre de son milieu intérieur, quelles que soient les contraintes externes
Qu’a permis le microscope optique ?
la théorie cellulaire
Qu’a permis le microscope électronique ?
définir l’ultrastructure des cellules et les organites intracellulaires
Théorie cellulaire
elle permet de classer les être vivants en procaryotes et en eucaryotes
Boucle de la construction d’une protéine
un gène code pour un message pour construire une protéine qui assure une fonction régulant le gène
Étapes successives nécessaires à l’isolement des cellules ?
- dissociation mécanique des tissus
- dissociation enzymatique par des protéines
- Identification des cellules et enrichissement des différentes populations cellulaires
Dissociation enzymatique des cellules de la MEC
utilisation d’enzymes protéolytiques qui digèrent la MEC
ex. trypsine
Dissociation enzymatique des cellules de jonction
utilisation des agents chélateurs (=emprisonneurs) du Ca2+
=> dissociation chimique
ex. EDTA
Enrichissement des différentes populations cellulaires grâce à …
- leurs propriétés physiques (taille, adhérence, densité)
- l’utilisions d’anticorps spécifiques couplés
- à la microdissection laser
À quoi peut être couplé un anticorps ?
- à un support
- à une coloration fluorescente
Principe centrifugation sur gradient de densité ?
séparer les cellules d’un tissu selon leur densité
ex. pour les lymphocytes
Fibroblastes
cellules qui réparent les tissus lésés et sont responsables des fibroses provoquées par le tabac
Tabac
détruit les alvéoles pulmonaires en épaississant leur paroi, et diminue par conséquent la diffusion d’O2, provoquant des essoufflement etc
Principe anticorps couplé à un support
l’anticorps monoclonal couplé à un support ou à un colorant fluorescent va venir reconnaître un antigène situé à l’extérieur de la cellule
À quoi peut-on retrouver les anticorps libres ou couplé ?
- du collagène
- une colonne de billes de polysaccharides
- une colonne aimantée
CD34+
marqueur de surface que l’on retrouve à la surface des cellules souches hématopoïétique
Définition cellules souche
cellules peu ou pas différenciées
Définition hématopoïétique
cellules du sang qui, lorsqu’elles portent ce marqueur, se différencient en globules rouges, blancs ou en thrombocytes
Anticorps couplé à un support dans le cas du CD34+
- l’anticorps, lié à une bille magnétique, va reconnaître le marqueur de surface CD34+ et la cellule souche va venir avec.
- il ne restera plus qu’a venir récupérer avec un allant ce complexe associatif
=> isolation de cellules souches
Principe FACS
mesurer les propriétés optiques de cellules transportées dans un liquide vecteur jusqu’à une source d’excitation lumineuse (laser)
Définition FACS
Florescence Activated Cell Sorter
Que permet le FACS
- analyser les cellules individuellement et de façon automatique
- étudier le cycle cellulaire
- isoler les sous population pures et stériles
- quantifier et répartir les sous populations cellulaires
Avantages FACS
- rapidité : 10 000 cellules en quelques minutes
- application aux cellules vivantes
- haut débit
- intégration de plusieurs paramètres
- marquages multiples
- possibilité de remis en culture
Application du FACS aux cellules vivantes
on peut trier les cellules en fonction de leur activité cellulaire selon l’angle de diffraction de la lumière qui les traverse
Que signifie un petit angle de diffraction en FACS ?
cellule en pleine activité dont la complexité interne est grande => beaucoup de faisceaux déviés
Que signifie un grand angle de diffraction en FACS ?
cellule en activité calme dont la complexité interne est plus faible
=> beaucoup de lumière la traverse
Que permettent les marquages multiples en FACS ?
d’isoler des populations très spécifiques
Fonctionnement FACS
- passage d’une population de cellules dans une chambre où il y a émissions d’un laser
- en fonction de l’excitation et de l’incidence du laser sur la cellule, on détermine des éléments sur la cellule
Que se passe-t-il si on utilise un flurorochrome en FACS
le laser va toucher la cellule marquée et émettre une longueur d’onde d’émission dans une autre gamme de fréquence
ce qui permet le repérage des cellules
Quelles informations nous donnent le FACS ?
- tailles cellule ; noyau ; REG
- quantité de mitochondries
- complexité interne
- clusters de différenciation
Principe microdissection laser
prélèvement de quelques cellules dans une coupe de tissu ou un tissu
Combien de types cellulaires la microdissection laser permet-elle d’étudier ?
un seul
ex. épithélium, structure vasculaire)
Sur quel tissu est-il inutile d’utiliser la microdissection laser ?
sur les tissus hématopoïétiques
=> ils y sont indépendants
Définition culture cellulaire
maintien in vitro des cellules pendant une durée variable
Combien de type de milieu de culture existe-t-il ? Lesquels ?
2 :
- milieux classiques
- milieu chimiquement définis sans sérum (SVF)
Milieu de culture classique
à une température de 37°C, on peut y mettre des substances nutritives élémentaires et des suppléments pour la division
Milieu de culture chimiquement défini
on y met des substances nutritives de base et des facteurs de croissance spécifiques
Substances nutritives élémentaires
- eau
- acides aminés
- glucose
- vitamines
- sels/ions
- oligoéléments
Suppléments pour la division
- sérum de veau foetal
- hormones
- facteurs de croissance
- protéines
- lipides
Substances nutritives de base
- insuline
- transferrine
- albumine
Facteurs de croissance
- EGF (endothelial growth factor)
- NGF ( neuronal growth factor)
- IL-2
Que peut-on ajouter dans ces milieux stériles ?
un indicateur coloré
ex. rouge phénol
Dans quel cas le milieu de culture est-il acide ?
s’il y a division
Que permet de détecter l’indicateur coloré ?
des infections bactériennes
=> les bactéries produisent de l’acide lactique qui fait diminuer le pH
Élevage dans la stérilité
- 37°
- CO2 à 5%
- manipulé avec un incubateur et sous une hotte
Dans quel cas sont utilisés ces milieux de culture stériles ?
- FIV
- vaccins
- thérapie cellulaire
- production de molécules
Principe culture primaire
prélèvement d’une cellule dans un organisme pluricellulaire et cultivation in vitro
Limites culture primaire
- non immortelle (max 1 semaine)
- phénomène de sénescence
Principe culture secondaire
repiquage des cellules dans une nouvelle boîte de culture avec un milieu de culture neuf
Quelles propriétés expriment les cellules in vitro ?
celles de leur tissu d’origine
Définition lignée
ensemble homogène de cellules dérivant toutes du même précurseur
Cellules normales en culture
- prolifération contrôlée
- nombre limité de divisions voire pas de divisions (>raccourcissement des télomères)
Cellules cancéreuses en culture
- autonomisées => pas de contrôle, n’écoutent pas l’organisme
- pas d’ancrage nécéssaire, peu de facteurs de croissance, perte d’inhibition totale
- immortelle (télomérase)
- métastases et migration
Définition métastase
foyer de cellules cancéreuse
Télomérase
enzyme ; complexe ribonucléoprotéique formé de 2 sous unités :
- TERT (protéique)
- TERC ( ARN)
Que permettent les cellules isolées à partir de tumeur ?
la création de lignées cellulaires (car possibilité de nombreux repiquages)
Comment peuvent évoluer les cellules normales ?
elles peuvent être transformées par des virus ou des mutations oncogènes et devenir immortelles
À quoi seraient dus 15 à 20% des cancers selon l’OMS ?
à des virus
Que permettent les cultures ?
- obtenir un grand nombre de cellules
- étudier l’influence du milieu
- étudier les interactions cellulaires (co-culture)
- obtenir une colonie
- créer un modèle cellulaire (=tester des médicaments)
Objectif clones de cellules mutantes
- étudier le contrôle du cycle de division cellulaire
- production d’anticorps monoclonaux
Quelles cellules peut-on prendre comme modèle pour un clone ?
- levures, protophytes eucaryotes
- xénope
Pourquoi les levures sont intéressantes en clonage ?
thermosensibles => possibilité d’induire ou d’inhiber les gènes avec la température
Pourquoi le xénope est intéressant en clonage ?
possibilité de tester l’impact tératogène des médicaments (car gros oeufs)
Comment est formé le phénotype ?
génotype + influence de l’environnement
Types de microscopie photonique
- à lumière blanche
- épifluorescence
- confocale
Types de microscopie électronique
- à transmission
- à balayage
Quelle est la différence entre microscopie électronique et photonique ?
- microscope électronique = faisceau d’électrons
- microscope photonique = faisceau de photons
Pouvoir de résolution oeil nu
0,2 mm
Pouvoir de résolution microscope optique/photonique
0,2 μm = 200nm
Pouvoir de résolution microscope électronique
- 2nm en MET
- 10nm en MEB
Quel est le facteur entre la résolution du MO et du ME
facteur 100
Taille atome, virus, bactérie, mitochondrie et cellule eucaryote
- atome : 0,2nm = 2Å
- virus : 100nm
- bactérie : 1 μm
- mitochondrie : μm
- cellule eucaryote : 10 à 30 μm
Combien vaut 1 μm ?
10^-6 m
Combien vaut 1 nm ?
10^-9 m
Combien vaut 1Å ?
10^-10m
En quelle année fut introduit le ME ?
1940
Qu’a permis le MO ?
le développement de la théorie cellulaire en 1838
Définition résolution
distance minimale entre deux objets distinguables
Formule résolution D
D = 0,61 x (λ/n.sinα)
avec n : plus petit indice de réfraction du trajet optique
α : angle du cône de lumière entrant dans la lentille
Comment évolue la résolution en fonction de la longueur d’onde ?
Si λ diminue, la résolution augmente
Comment évolue la résolution en fonction de la concentration de lumière
Si n ou α augmente, la résolution augmente
Que signifie augmenter le pouvoir de résolution
diminuer la limite de résolution D
Principe du microscope photonique
augmentation du contraste grâce à des colorations avec + ou - d’immunomarquage
(possibilité de contraste de phase ou de contraste interférentiel)
Carte préparations pour une observation au microscope (p.171)
par coeur
La résolution est proportionnelle à …
la longueur d’onde de la radiation utilisée pour interférer avec les structures
Longueur d’ondes des électrons
10^-3 à 1 nm
Longueur d’ondes des photons
400 à 700 nm
Quelle influence a la vitesse des électrons sur la longueur d’onde
plus la vitesse est élevée, plus la longueur d’onde diminue
Que permet la microscopie électronique ?
- voir des objets très petits
- voir des détails
- faire des reconstitutions 3D
Quelle préparation nécessite le ME ?
- fixation
- coupe fine (pas de coupe pour le MEB)
- utilisation de métaux lourds
Que permet d’observer le MET ?
l’intérieur de la cellules avec les différentes structures, les différents constituants et la surface de l’échantillon
Que permet l’observer le MEB ?
des représentations 3D avec relief et profondeur de champ
Grossissement MET
1500 à 500 000
Limite de résolution MET
2nm
Principe MET
faire passer un faisceau d’électrons dans un environnement rempli de vide et à travers une coupe ultrafine d’un échantillon biologique, contrastée par un dépot métallique.
Ce faisceau est ensuite agrandi par des électroaimants et vient former une image sur un écran fluorescent ou sur un film photographique
Que permet le vide dans un MET ?
l’accélération des électrons
Grossissement MEB ?
20 à 400 000
Limite de résolution MEB ?
≥ 10nm
Profondeur de champ MEB ?
quelques millimètres
Principe du MEB
les électrons sont réfléchis sur l’objet puis repris par un détecteur.
Les dessiccations se font sans rétraction et on y dépose de l’or
Définition dessiccation
l’eau est retirée
Comment se fait la préparation au MEB ?
- prélèvement
- fixation (glutaraldéhyde)
- déshydratation (acétone)
- métallisation (or et platine)
Qu’est-ce qu’on observe au MEB ?
Une image 3D de cellules intactes et de leurs constituants cellulaires
Principe cryofracture au MET
- congélation de la cellule à -196°C
(azote liquide) - séparation des hémicycles-couches de la membrane
- application d’un ombrage et d’une réplique sur chaque moitié
Principe fractionnement subcellulaire
separation, isolation et purification des organites et macromolécules pour étudier leurs fonctions
Etapes fractionnement subcellulaire
- homogénéisation
- centrifugation
Homogénéisation en fractionnement subcellulaire
rupture de la membrane plasmique par :
- choc osmotique ou ultrasons
- choc mécanique (=Potter)
Ultrasons
dégraissage agissant sur les lipides
Schémas centrifugation p.175
par coeur !!!
Comment peut se faire la séparation des organites ?
sédimentation à l’équilibre grâce à un gradient de sucrose : on met plusieurs couches de sucrose de densités différents, les différents organites vont se placer entre les deux couches de densité voisine par ultracentrifugation
Définition coefficient de sédimentation
vitesse à laquelle un constituant sédimente : loi de Stockes
> s’exprime en Svedberg (S)
Que peut-on utiliser pour analyser la sous partie isolée ?
des enzymes spécifiques de cette fraction
Avec quoi le coefficient de sédimentation est-il en relation ?
avec les caractéristiques de taille et de forme des objets
Les coefficient de sédimentation sont-il additif ?
non
Caractéristiques ADN
- longueur démesurée (1,80m)
- chimiquement monotone
- 6.10^9 nucléotides = 3.10^9 pb
Sur quoi agit la technique Southern ?
ADN
Sur quoi agit la technique Northern ?
ARN
Sur quoi agit la technique Western ?
protéines
Étapes techniques Southern, Northern, Western
- électrophorèse
- transfert sur un filtre par capillarité (=blotting)
- hybridation
- révélation
Qu’utilisation pour la révélation (Northern, Southern, Western)
- une chromatographie
- une électrophorèse sur gel de polycrymalide en 2D
- un séquençage de protéines (forme et fonction)
Comment peut être estimé le poids moléculaire de l’ADN, ARN et des protéines ?
par l’électrophorèse sur gel
Principe hybridation des acides nucléiques
une sonde d’ADN est couplée à un radio-isotope ou à un marqueur chimique/fluorescent . Les sondes ne s’hybrident qu’avec les séquences complémentaires
Définition stingence
sélectivité
Comment peut on augmenter la stingence ?
en augmentant la température ou en diminuant la concentration du gel
Principe des protéines chimères fluorescentes
on construit un gène codant pour la protéine d’intérêt en ajoutant de green fluorescent protein (GFP), permettant d’obtenir une protéine fluorescente
Transfection des protéines chimères fluorescentes
on introduit le tout dans la cellule avec un vecteur (car la protéine étant chargée négativement, elle a besoin d’aide pour passer la membrane)
Que permettent les protéines chimères fluorescentes ?
une visualisation cellulaire, souvent au microscope confocal
Que permet l’utilisation de précurseurs ?
des études cinétiques
Citez les différents types de précurseurs
- radioactifs
- autre
Précurseurs radioactifs et leurs rôles
- 3H-thymidine : l’ADN est synthétisé dans le noyau et y reste
- 3H-uridine : l’ARN est synthétisé dans le noyau et migre dans le cytoplasme
- 3H-leucine : pulse-chalse des protéines du RE vers Golgi
Principe flux d’ions
- utilisation d’une pipette en verre pour isoler un canal ionique (=patch)
- électrodes reliés à un système d’enregistrement prenant en compte les variations de tensions
- passage d’ion = potentiel de membrane
A quoi sert la technique de flux d’ions ?
à préciser les conditions électro-physiologiques pour l’état d’ouverture ou de fermeture des canaux ioniques
La biologie cellulaire est une discipline…
expérimentale
> les résultats se complètent (=combinaison)
> l’évolution est rapide
> les techniques et les connaissances se complexifient
