Mechanism of Transcription Flashcards
Når og hvem oppdaget strukturen til DNA?
- Strukturen av dobbel heliks til DNA ble oppdaget i 1953 av Rosalind Franklin og Maurice Wilkins.
Når og hvem oppdaget den genetiske koden? (Sentrale dogmet)
- ble oppdaget i 1953 av J. Watson og F. Crick.
Den genetiske koden er lagret i…, vedlikehold under…, uttrykt under…
- Lagret i DNA
- Vedlikeholdt under replikasjon
- Uttrykt under transkripsjon
- (Brukt under translasjon)
Hva er forskjell/likhet mellom DNA transkripsjon og DNA replikasjon?
• Likheter:
- Begge involverer enzymer som syntetiserer en ny strand av nukleinsyre komplementær til DNA templat strand.
• Ulikheter:
- RNA pol trenger ikke en primer for å starte RNA syntese.
- Nylig syntetisert RNA er singel-strand og lagt av ribonukleider (rNTP).
- RNA inneholder uracil i stedet for thymin.
- RNA produkt forblir ikke base-parret til templat DNA.
Hva er mest nøyaktig av DNA transkripsjon og DNA replikasjon og hvorfor er det sånn?
- DNA transkripsjon er mindre nøyaktig.
- Replikasjon er nøyaktig fordi DNA pol har effektiv rettlesning -> lager 1 stabil kopi av hele genomet som blir overfør til datter celle. Katastrofiske mutasjoner kan bli overføt til neste generasjon.
- Transkripsjon er mindre nøyaktig fordi RNA pol har dårlig rettlesning -> lager flere kortlevde kopier av selekterte området. En feil vil påvirke noen få mRNA og forsvinne.
Hvilke oppgaver har DNA replikasjon og DNA transkripsjon?
- DNA replikasjon produserer en stabil kopi av hele genomet som bli overført til dattercelle.
- DNA transkripsjon lager mange ustabile kopier av gener.
Hvordan ser RNA pol ut i prokaryote og eukaryote?
- Veldig likt
- De har samme organisering
- Samme form (som en krabbeklo)
- De har to store og konserverte subenheter med katalytisk aktivitet og mange mindre og mindre konserverte subenheter.
Hvor mange RNA pol finner man i eukaryote og prokaryote?
- Eukaryote: har 3 RNA polymerase (RNA pol I, RNA pol II, RNA pol III). (+ IV og V i planter)
- Prokaryote: har 1 RNA polymerase (RNA pol A).
Hva gjør RNA polymerase I?
- Transkriberer ikke-kodende ribosomal RNA gener til ribosomal RNA (rRNA).
- 1 gen, 200 kopier
Hva gjør RNA polymerase II?
- Transkriberer protein-kodende gener til mRNA
- 20,000-25,000 gener i mennesker.
- (Mest studerte av alle polymeraser)
Hva gjør RNA polymerase III?
- Transkriberer ikke-kodende transfer RNA gener til transfer RNA (tRNA)
- 50-100 gener, 500 kopier.
Hva er transcription start site (TSS), aka +1?
- +1 er der transkripsjonen starter
Hva er transcribe region, aka open reading frame (ORF)?
- Den DNA sekvensen som er transkribert til RNA via RNA pol.
Hva er transcription termination site (TTS)?
- Der transkripsjonen slutter
Hva er den enzymatiske reaksjonen til transkripsjon?
RNAn + rNTP + (Mg2+ + templat) -> RNAn+1 + PPi (C)
Hva er den overordnede mekanismen til RNA pol?
- RNA pol «åpner» og «smeltes» til DNA og danner en transkripsjons boble.
- RNA pol festes til og leser templat DNA strand i 3’ -> 5’ retning og katalyserer produksjonen av en komplementær RNA i 5’ -> 3’ retning.
Altså….
«Åpning» av DNA -> base paring av rNTP til templat strand -> formering av ny fosfodiester binding.
Hva har lik sekvens d
som nontemplate DNA strand (aka kodende strand)?
- RNA som er transkribert av templat strand.
Hvilke tre steg inngår i transkripsjon?
- Initiering (initiation)
- Elongering (elongation)
- Terminering (termination)
Hvilke tre sub-steg inngår i initiering av transkripsjon?
- Montering av transkripsjon maskineri ved promoter -> lukket kompleks (DNA er lukket).
- Åpning av transkripsjon boble -> åpent kompleks (DNA er åpent).
- Første rNTP inkorporeres -> initiering transkriberende kompleks.
Hvilke steg inngår i elongering av transkripsjon?
- RNA pol rømmer fra promoter og beveger seg langs transkriberende område imens den syntetiserer RNA.
- Mekanismen til RNA pol ved elongering:
- > Retter opp DNA i fronten
- > Inkorpererer rNTP og danner fosfodiester binding
- > Dissosiere begynnende RNA fra DNA templat
- > Tvinner DNA etter reaksjonen
Hva skjer ved terminering av transkripsjon?
- Terminering skjer når RNA pol kommer til Transcription Termination Site (TTS).
- RNA pol dissosieres fra DNA -> RNA produkt dissosieres fra polymerase.
For bakterier (in vivo). Hvor starter transkripsjonen?
- In vivo starter transkripsjon kun ved gen promoterer.
- Initieringsfaktor σ (σ-faktor) assosierer med RNA pol kjerne -> dette danner et holoenzym.
- Holoenzym kan spesifikt gjenkjenne promoter.
Hva er σ-faktorer?
- Det er initeringsfaktorer som kobles til RNA polymerase kjerne.
- Finnes flere σ-faktorer, men σ70 er dominerende i E.coli.
Hvilke elementer på bakteriell promoter gjenkjennes av σ70-holoenzym (σ70 faktor + RNA pol)?
- -35 og -10 elementene (downstream for +1)
- -35 og -10 er separert med 17-19 nukleotider.
• Andre elementer er
- > UP-element
- > Utvidet -10
- > Discriminator
Hvor mange regioner er σ70 delt inn i?
- 4 regioner -> σ1-4
Hvordan interagerer σ70 med RNA pol når det dannes Holoenzym ved LUKKET KOMPLEKS ?
- Element -35 gjenkjennes av σ4.
- Element -10 gjenkjennes av σ2.
- Utvidet -10 gjenkjennes av en α-heliks i σ3.
- Discriminator gjenkjennes av σ4.
Hva skjer med RNA pol når den går fra LUKKET KOMPLEKS -> ÅPENT KOMPLEKS?
- I lukket kompleks er σ1.1 mellom β og β’ clamp for å unngå uønsket lukking av RNA pol.
- Fra lukket til åpent skjer: σ1.1 fjernes fra ββ’ klo -> ββ’ klo clamp lukkes og sikrer DNAet, nå kan transkripsjonsboblen dannes.
Hvordan dannes transkripsjon bobbelen? initiering av ÅPENT KOMPLEKS
- Den dannes ved -10 elementet mellom -11 og +2 av promotoren.
- Åpning av dsDNA skjer via isomerisering:
• σ2 inneholder to lommer; en for A-11 (alanin -11) og en for T-7 (tyrosin -7) i -10 elementet.
• A-11 og T-7 er isomerisert (flippet) inn i disse lommene -> danner ssDNA. - ISOMERISERING ER IRREVERSIBEL -> TRANSKRIPSJON VIL STARTE
Hvilke mekanisme involverer scrunching (skraping)?
- Transkripsjon som går feil
- Det prod <10 langt feil RNA før RNA pol begynner med elongering.
- Scrunching er:
• RNA pol syntetiserer feil RNA uten å bevege seg langs templatet -> dermed blir templatet skviset inn i det aktive setet på RNA pol = scrunching. - Scrunching skjer flere ganger før RNA pol syntetiserer et korrekt mRNA.
Hvordan skjer promoter escape?
- Når begynnende RNA har nådd 10nt -> Holoenzym løses opp, σ-faktor går ut av RNA pol -> RNA pol elongering
Hvilke to proofreading mekanismer er det ved elongering som fjerner misinkorpiert nukleotider?
- Pyrofosforlytisk redigering: katalytisk aktivitet i revers.
- Hydrolytisk redigering.
Hvordan er mekanismen ved elongering?
- rNTP og downstream DNA entrer via dedikerte kanaler.
- En rNTP er lagt til om gangen -> nytt fosfodiester binding -> RNA pol translokeres til neste nukleotid.
- RNA og upstream DNA forlater via dedikerte kanaler.
Hva skjer om RNA pol møter på skadd DNA under transkribering?
Skadd DNA -> RNA pol stopper opp -> stoppet RNA pol blir fjernet av TRFC ved hjelp av ATP -> DNA bli reparert av transkripsjon-koblet reparering, her blir Nucleotide excision repair proteiner rekruttert (UvrABC) -> DNA lesion er fjernet og reparert -> transkripsjon fortsetter
Hvordan skjer terminering av transkripsjonen?
- Terminering er dissosiering av RNA, DNA og RNA pol
- Skjer ved sekvenser kalt terminators som er ved enden av genet.
Hvilke to mekanismer inngår i terminering av transkripsjon?
- Rho-avhengig
- Rho-uavhengig
Hva er rho-avhengig terminering?
- Rho er en homohexamer som er O-ring formet.
- (Husk i bakterier skjer transkripsjon og translasjon samtidig)
- Rho binder til begynnende RNA bare i fravær av ribosom ved et Rho bindesete (Rut).
- Mekanismen er ukjent, men er ATP-avhengig. Mest sannsynlig trigger Rho konformasjonsendring i RNA pol som trigger terminering.
Hva er Rho-uavhengig terminering?
- En slik terminering krever en spesifikk terminator.
- Terminatoren inneholder inverse repetisjoner av 20nt etterfulgt av 8 A:T base par.
- Mekanismen:
• Når transkribert vil den inverse rep danne en hairpin.
• Hairpinen kan trigge terminering på samme måte som Rho-avhending terminering.
• Det A:T rike området danner A:U bindinger som er svalene enn C:G eller A:T -> dette gir dissosiering av RNA:DNA duplex.
Hva er den mest regulerte og forståtte eukaryotisk polymerase?
RNA pol II
Hva er de overordnede stegene for initiering av transkripsjon ved RNA pol II?
PIC montering ved kjerne promoter -> overgang fra lukket til åpent kompleks -> promoter escape
Hva er en kjærne (core) promoter?
- Er et minimalt sett av DNA sekvenser som er nødvendig for transkripsjonel initiering av RNA pol II.
- Ligger vanligvis 40-60bp upstream eller downstream for TSS (+1)
Hva består kjærne (core) promoter av?
- TFIIB gjenkjennings element (BRE)
- TATA boks
- Initiator (InR)
- Downstream promoter elementer:
• DPE
• DCE
• MTE - Mest vanlig sammensetninger av en kjærne promoter er: InR + TATA boks og TATA boks + DPE.
Hva er preinitiation komplekset (PIC)?
- Består av RNA pol II + generell transkripsjons faktorer (GTF) ved kjærne promoter.
Hva er generelle transkripsjonsfaktorer faktorer (GTF)?
- Proteiner som utfører samme funksjon i eukaryote som σ-faktorer gjør i bakterier.
- Altså, stimulerer transkripsjon initiering.
- De gjør følgende oppgaver:
- > Gjenkjenner og interagerer med kjærne promoter.
- > Rekruterer, stabiliserer og posisjonerer RNA pol II ved kjærne promoter.
- > DNA åpning/smelting.
Hva er TFIID?
- Generel transkripsjon faktor (GTF).
- Et stor multi-subenhet kompleks dannet av TBP (TATA binding protein) og 13 TAF (TBP-assosierte faktorer)
Hva gjør TBP?
- TBP er TATA binding protein
- Gjenkjenner TATA boks ved kjærne promoter.
- > TBP interagerer med DNA minor groove
- > TBP trigger en sterk bøying av DNA ved TATA boks.
Hvilke generelle transkripsjon faktorer er å finne i eukaryote?
- 6 stykker: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIH og TFIIF.
Hva gjør TFIIA og TFIIB?
- Stabiliserer TBP (TATA binding protein) ved TATA boksen.
Hva gjør TFIIF og RNA pol II?
- De rekrutteres sammen
- Danner og stabiliserer lukket kompleks.
Hva gjør TFIIE og TFIIH?
- TFIIE promoterer rekruttering av TFIIH.
- TFIIH består av 10 subenheter:
- TFIIH har 3 enzymatiske aktiviteter:
• XPD = Helicase (DNA reparering)
• XPB = Translocase
• CDK7 = Kinase - TFIIH funksjon:
• Formering av åpen kompleks.
• Promoter escape.
Hvordan skjer overgangen fra lukket til åpent kompleks i eukaryote?
- TFIIH translocase aktivitet av XPB åpner opp DNA ved å bruke energi fra ATP hydrolyse -> PIC klar for initiering
- Som for bakterier, initiering transkriberende kompleks involverer mislykket (aborative) mRNA syntese og skraping (scrunching).
Hvordan skjer promoter escape i eukaryote?
- TFIIH (CDK7) fosforylerer Serin 2 og 5 på CTD på RNA pol II -> promoter escape + mRNA capping.
- CTD er et langt C-terminal domene på RNA pol II.
Hva assosierer RNA pol II med under elongering?
- CTD fosforylering av Serin 2 av P-TEFb
- Binder elongerings faktorer som stimulerer til elongering.
- Binder prosessering faktorer
Hva er og ha gjør P-TEFb?
- En positiv elongerings faktor
- P-TEFb fosforylerer CTD Serin 2.
- P-TEFb promoterer RNA pol II pause release ved å fosforylerer NELF og DSIF.
Hva gjør FACT (FAcilitates Chromatin Transcription)?
- Under transkripsjon så må nukleosomer fjernes.
- FACT hjelper RNA pol II å fjerne nukleosomer.
- FACT består av to subenheter; SPT16 og SSRP1, hvor:
- > SPT16 binder til histon dimer H2A•H2B
- > SSRP1 binder til histon dimer H3•H4.
Hvordan opererer FACT (FAcilitates Chromatin Transcription)?
- Via en to-stegs mekanisme:
1. FACT fjerner H2A•H2B foran RNAP II -> RNAP II kan beveges
2. FACT reposisjonerer H2A•H2B etter RNAP II har passert -> vedlikeholder kromatin integritet.
Hva kan bindes til fosforylert CTD under elongering?
- RNA prosessering enzymer -> disse enzymene blir overført fra CTD til RNA.
- Fosfo-Serin 5 rekruterer capping enzym
- Fosfo-Serin 2 rekruterer splicing ig poly-adenylering enzym.
Hvordan skjer mRNA capping i eukaryote?
- Capping enzymer er rekruttert av CTF fosfo-Serin 5.
- Capping skjer ved å linke en metylert guanin i posisjon 7 (m7G) på 5’ fremre RNA i en 5’-5’ binding m/3 fosfater.
- RNAP II stopper under capping.
- Er 3 hovedreaksjoner: RNA trifosfat -> guanylyltransferase -> methyltransferase.
Hva er rollen til gunanin methyl cap?
- Regulering av kjerne eksport.
- Preventere degradering via exonucleaser.
- Promotere translasjon.
Hvordan skjer mRNA polyadenylering mhp RNAP II?
- Polyadenylering er det siste steget før terminering av transkripsjon.
- Polyadenylering enzymer CstF og CPSF er rekruttert av CTD fosfo-Serin 2.
- Ved slutten av gener er spesifikke poly-A DNA sekvenser transkribert -> dette trigger overføring av Polyadenylering enzymer CstF og CPSF fra CTD til RNA -> videre kløyver CstF og CPSF fremre RNA fra RNAP II -> til slutt legges til en poly-A hale av poly-A polymerase (PAP).
Hva er rollen til poly-A halen?
- Forhindre degradering av RNA av exonucleaser.
Hvordan skjer terminering av transkripsjon i eukaryote?
- Terminering skjer via torpedo modellen (mekanisme likt Rho):
• Exonuclease Rat1 (gjær) XRN2 (human) er rekruttert.
• Den andre RNAen blir degradert av exonuclease Rat1/XRN2 -> Rat1/XRN2 fester seg til uncapped RNA og dytter den fremover -> RNAP II dissosierer dermed fra DNA og transkripsjonen har dermed sluttet.
Hva skjer med RNAP II etter kløyving og Polyadenylering?
- RNAP II fortsetter å transkribere flere kb av DNA selv etter kløyving og Polyadenylering av mRNA. Danner en andre uncapped RNA.
- Den andre uncapped RNA legger grunnlaget for terminering av transkripsjon (torpedo modellen).
Hva er det som distinkterer de 3 eukaryotiske polymerasene?
- De bruker forskjellige kjærne (core) promoterer.
- De bruker forskjellige generelle transkripsjon faktorer (GTF).
Hvilken RNA finner man mest av i cellen (human)?
- rRNA, 80% av all RNA.
