manipulation génétique Flashcards
principe de la manipulation génétique
inhiber (KO, knock out) ou augmenter (KI, knock
in) l’expression d’un gène dans différents modèles
in vitro
cultures primaires de cellules lignée
in vivo
- Embryon ou adulte (KO conditionnel)
- Dans tout l’organisme (KO total)
- Tissu/Cellule spécifique (KO spécifique)
Comment bloquer l’expression d’un gène ?
siRNA
Quel est le mécanisme de l’interférence ARN par les siRNA ? (7)
- Les siRNA sont reconnus dans le cytoplasme de la cellule par un complexe protéique, nommé complexe RISC (RNA Induce Silencing Complex)
- Celui-ci s’active en libérant le brin complémentaire de l’ARN ou brin sens.
- Le complexe activé reconnait son transcrit cible, un ARN messager, par complémentarité des bases.
Ce système de reconnaissance assure la haute spécificité du mécanisme. - Une fois la cible liée, l’endonucléase Argonaute (Ago), appartenant au complexe RISC, coupe le transcrit au niveau du site de reconnaissance.
- Les deux morceaux du transcrit clivé par Ago sont rapidement dégradés via leurs extrémités par des exonucléases.
- La transfection de petits ARN interférents dans les cellules a donc pour conséquence la destruction spécifique des ARN messagers ciblés
- empêchant toute nouvelle traduction de la protéine codée par ces ARN messagers
principe du système Cre/Lox
la cre recombinase va exciser le gène compris entre les 2
séquences loxP
–> Situation de KO d’un gène
mécanisme Cre/Lox
- Ciblage d’une séquence spécifique d’ADN (lox)
- Épissage à l’aide d’une enzyme appelée la recombinase CRE.
- CRE (cyclic recombinase) catalyse la recombinaison entre deux site de reconnaissance, les sites Lox
comment faire sauter un gène uniquement dans un type de cellule?
On réalise une construction ou ‘‘cre’’ ne s’exprime que dans un type de cellule:
-on insère ‘‘cre’’ en aval d’un promoteur ‘‘cellule spécifique’’ (l’albumine pour le foie, l’insuline pour la cellule B pancréatique, etc)…
comment faire « sauter » la lipoprotéine lipase (LPL) dans des neurones?
Pour cela, il faut:
1. Des Souris « lox » pour la LPL
2. Souris « Cre » qui s’exprime sous le contrôle d’un
promoteur spécifique des neurones… NEX est un
exemple de promoteur « neurone spécifique »
3. On croise les souris «Lox » et les souris « Cre- NEX »
4. Les souris résultantes de ce croisement ne
synthétiseront plus de LPL dans les neurones
sur quoi l’invalidation de LPL dans les neurones a une conséquence?
sur le poids
comment avoir des souris KO pour le récepteur de l’insuline (IR)
Il suffit d’avoir des souris IR-lox et on les croise
avec les souris Cre de notre choix:
-Liver IRKO… LIRKO (Albumine-Cre x IRLox)
-Muscle IRKO… MIRKO (Actine-Cre x IRLOx)
-β cell IRKO… βIRKO (Insuline-Cre x IR-Lox)
-Neurons IRKO… NIRKO (NEX-Cre x IRLox)
LIRKO conséquence
LIRKO sont intolérantes au glucose et à l’insuline (insulino-résistantes)
MIRKO conséquence
-La capture de glucose est diminuée dans le muscle
et augmentée dans le tissu adipeux (fat):
-Donc elle stocke plus de triglycérides dans le tissu
adipeux et devient obèse
autre fonction de Cre/Lox
-gain de fonction –> faire une surexpression d’un gène
Éléments et fonctions de base du système CRISPR-Cas (4)
1.Le système CRISPR-Cas est constitué:
- des gènescas (CRISPR-associated),
- du locus CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats)
-et d’une séquence leader.
2. Le locus CRISPR est composé d’une alternance de courtes séquences nucléotidiques répétées intercalées entre des séquences variables.
3.Lors de l’acquisition d’un nouvel espaceur, les protéines
Cas1 et Cas2 dirigent l’ADN exogène vers l’extrémité du locus CRISPR où il sera intégré.
4. Lors d’une infection subséquente, l’endonucléase du système, guidée par des ARNcr, induit une coupure double-brin dans l’ADN étranger
Représentation du système CRISPR/Cas9
comment couper un gène? (4)
- il faut un ARN guide (ARNg) complémentaire à une séquence de 17 à 20 nucléotides du gène ciblé.
–> La seule restriction est que cette séquence doit être suivie par une séquence NGG ou NGA (appelée un PAM). 2. L’ARNg forme un complexe avec l’ADN et la
nucléase Cas9. - La coupure par la nucléase se fait exactement trois nucléotides avant le PAM.
- Les lignes pointillées relient les séquences de nucléotides qui sont les mêmes avant et après la coupure.
comment éviter de couper des séquences d’ADN similaire à celle ciblée? (3)
- il est possible d’utiliser une nucléase Cas9
non-fonctionnelle (dCas9) qui est fusionnée
avec la nucléase FokI. - La nucléase FokI doit former un dimère pour couper l’ADN.
- Ce dimère ne peut être formé que si deux
ARNg ciblent des séquences de nucléotides séparées de 13 à 17 nucléotides.
Utilisation du système CRISPR/Cas pour éliminer une séquence d’ADN
- Il est possible de couper, en utilisant deux ARN guide (ARNg), les deux brins d’ADN à deux endroits dans un même chromosome.
- -> Ceci permet d’enlever une séquence de quelques nucléotides ou même de centaines de milliers de nucléotides.
Modifications de l’expression d’un gène
par le système CRISPR/Cas9
Le système CRISPR peut être utilisé pour réprimer ou induire l’expression d’un gène.
- il faut cibler avec l’ARN guide (ARNg) une séquence de
nucléotides dans le promoteur du gène à modifier et utiliser une protéine Cas9 non fonctionnelle (dCas9).
–> La simple présence de la protéine dCas9 diminue
l’expression du gène. - Il est aussi possible de fusionner la protéine dCas9
avec un inhibiteur de la transcription tel que la
protéine KRAB. - Pour augmenter l’expression d’un gène, la protéine dCas9 peut être fusionnée au peptide viral VP64 qui
recrute ensuite des facteurs de transcription.
délétion des mutation avec CRISPR-Cas9 (4)
- La mutation causant la dystro- phie musculaire de Duchenne dans le modèle murin utilisé se situe dans l’exon 23
- En ciblant à l’aide de deux ARNg les régions flanquant cet exon, celui-ci est excisé du génome et la coupure double-brin est réparée par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ)
- créant une protéine tronquée mais fonctionnelle.
- Les mêmes étapes peuvent être utilisées dans un modèle de maladie de Huntington
- en utilisant des ARNg spécifiques des régions flanquant la région des triplets CAG dans le gène huntingtin qui cause la maladie
