Les mutations et la réparation de l’ADN Flashcards
1
Q
Quel est le chemin des ARNt? Que transportent-ils?
A
Dans le cytoplasme, les ARNt transportent les a.a. vers les ribosomes qui traduisent le message de l’ARNm encrypté sous forme de triplets de ribonucléotides en une série d’a.a. attachés par des liaisons peptidiques.
2
Q
Définir génon, codon et anticodon
A
Génon(1):3 désoxyribonucléotides consécutifs du brin matrice de l’ADN. Il est transcrit en codon.
Codon(2): 3 ribonucléotides consécutifs d’une molécule d’ARNm complémentaires à un génon.
* et 3 désoxyribonucléotides du brin codant de l’ADN complémentaire au génon.
Anticodon(3): 3 ribonucléotides consécutifs d’ARNt complémentaires à un codon spécifique de l’ARNm.
3
Q
Les séquences sont nommées de ______ vers ______.
Les séquences complémentaires sont ___________.
A
- 5’ vers 3’
- antiparallèles
4
Q
Que représente un triplet de nucléotides?
A
Un triplet de nucléotides(UAC, AUG, etc.) code pour un acide aminé:
possibilité de coder 64 acides aminés (4 bases azotées différentes en triplets: 43= 64) mais il n’y a que 20 acides aminés.
—> Pour cette raison plusieurs triplets de nucléotides codent pour le même acide aminé: redondance, dégénérescence du code génétique.
5
Q
Comment est le cadre de lecture? Qu’est-ce que cela permet?
A
Les codons sont lus sans chevauchements.
—> Si une mutation substitue un nucléotide par un autre, alors un seul codon est affecté. S’il y avait
chevauchement, 3 codons seraient affectés.
—> Le cadre de lecture indique comment il faut lire la séquence : On le trouve en identifiant le codon de
départ (AUG = a.a. méthionine) sur la séquence (la recherche se fait du 5’ vers 3’).
6
Q
Quelles sont les étapes pour passer de l’ADN à la protéine (5 étapes)?
A
1- ADN (brin anti-codant/brin matrice) : possède les génons
2- Transcription
3- ARNm : possède les codons
4- Traduction
5- Protéine : possède les acides aminés
7
Q
Quels sont les divers types de codons (3)?
A
Codons d’initiation: marquent le début de la lecture de l’ARNm.
o Tous: AUG méthionine pour les eucaryotes et N-formyl-méthionine pour les procaryotes)
o Autres possibilités chez procaryotes : GUG (valine) et UUG (leucine).
Codons des acides aminés: codent pour les 20 acides aminés
Codons de terminaison (STOP): indiquent la fin de la lecture de l’ARNm. UAG, UAA et UGA
8
Q
Que faut-il faire pour trouver un cadre de lecture?
A
Pour trouver un cadre de lecture, il faut chercher (sur l’ARNm ou sur l’ADN codant 5’ vers 3’) le premier codon «AUG» (ou «ATG»). À partir de lui, la séquence codante se poursuit, par triplets, sans chevauchement, jusqu’au codon «STOP».
9
Q
Définir mutations.
A
Les mutations ≡ tous les changements de la séquence de l’ADN.
10
Q
Les mutations sont classées en 3 manières, quelles sont-elles?
A
o Selon l’effet sur la structure (d’ADN) : simple (small-scale) ou profond (large-scale)
o Selon l’effet sur la fonction (de la protéine) : perte-de-fonction, gain-de-fonction
o Selon l’effet sur la valeur adaptative : néfaste, bénéfique, neutre.
11
Q
Quelles sont les conséquences des mutations selon le type cellulaire affecté (2)?
A
—> Dans la cellule germinale(production des gamètes): affecte les générations suivantes
—> Dans la cellule somatique: affecte l’individu (ex: mutations dans la régulation du cycle cellulaire= cancer)
12
Q
Quels sont les types de mutations ponctuelles (modifications simples) (2)?
A
Substitution de nucléotides.
o Pendant la réplication
o Modification de la structure chimique d’un nucléotide déjà présent.
Indels: insertion/délétion d’une paire de nt.
13
Q
Quels sont les effets d’une substitution de bases sur l’ADN (3)?
A
- Mutation silencieuse = aucun effet sur la séquence d’acides aminés, remplacé par un autre nucléotide —> ne change pas l’acide aminé
- Faux-sens = bénéfiques ou néfastes, remplacé par un autre nucléotide —> change l’acide aminé
- Non-sens = arrêt prématuré
14
Q
Quels sont les effets d’une insertion/délétion d’une ou plusieurs bases paires de bases sur l’ADN (3)?
A
- La délétion engendre un décalage du cadre de lecture qui entraine un faux-sens (différent acide aminé)
- L’insertion engendre un décalage du cadre de lecture qui entraine un non-sens (arrêt prématuré)
- L’insertion ou la délétion d’un triplet n’affecte pas le cadre de lecture mais entraine l’ajout ou la perte d’un acide aminé
15
Q
Quels sont les types de modifications profondes (4)?
A
o Insertion ou délétion larges (une séquence et non 1-2 nt)
o Réarrangement chromosomique : modification de l’organisation d’une large région chromosomique (change l’ordre des gènes). Translocation, recombinaison aberrante, inversion, déplacement des transposons…
o Amplification génétique : répétitions anormales de régions de l’ADN suite à la réplication. Duplication de gène complet, de partie de chromosomes ou extension des séquences répétées (microsatellites)
o Anomalies chromosomiques (ex.trisomie).
16
Q
Quels sont les effets d’un changement dans la séquence qui code une protéine?
A
Une protéine différente dont la forme, l’activité ou l’association à d’autres protéines a été changée.
17
Q
Quels sont les effets d’un changement dans la région régulatrice de l’expression génique ou dans la structure globale de l’ADN?
A
La protéine n’est pas modifiée, mais elle n’est plus produite au moment adéquat ou n’est plus produite du tout.
18
Q
Vrai ou faux : Les mutations sont à la base du polymorphisme, des allèles, de l’évolution et de certaines maladies.
A
Vrai
19
Q
Que permettent les mutations?
A
Les mutations permettent la variation génétique nécessaire à l’évolution.
—> Les mutations peuvent être bénéfiques et permettent une meilleure adaptation à l’environnement.
20
Q
Quelles sont les origines possibles des mutations (3)?
A
o Les erreurs de la réplication: mésappariement (mutations ponctuelles, 1 nt à la fois) ou glissement de l’ADN polymérase (microsatellites)
o Un endommagement chimique de l’ADN (l’ADN a une stabilité limitée): les altérations spontanées (hydrolytiques) ou environnementales (agents mutagènes et radiations)
o La transposition des séquences d’ADN
21
Q
Quels sont les effets possibles des mutations (3)? Quelle origine de mutation provoque ces effets?
A
o Un changement dans la séquence codant une protéine (une protéine différente dont la forme, l’activité ou l’association à d’autres protéines a été changée) = Les erreurs de la réplication et un endommagement chimique de l’ADN
o Un changement dans la région régulatrice de l’expression génique (la protéine est plus/moins présente ou présente à un moment différent du développement ou dans des circonstances différentes.) = Les erreurs de la réplication et un endommagement chimique de l’ADN
o Un changement dans la structure de l’ADN qui empêche la réplication et la transcription. = Un endommagement chimique de l’ADN
22
Q
Définir substitutions.
A
Les substitutions : le mésappariement d’un nucléotide. La réplication suivante assure ensuite d’intégrer la modification de manière permanente sur les deux brins.
23
Q
Qu’est-ce que les substitutions impliquent (2)?
A
Impliquent les mécanismes de réplication de l’ADN :
—> une erreur est introduite pendant la réplication et n’est pas réparée.
—> une modification de la structure chimique d’un nucléotide déjà présent induit une erreur de lecture de la polymérase qui associe la mauvaise base azotée.
24
Q
Quelles sont les 2 classes de substitutions?
A
- La transition d’une pyrimidine à une autre (C à T) ou d’une purine pour une autre (A à G)
- La transversion d’une pyrimidine pour une purine (T pourA ou G) ou le contraire
25
Qu’est-ce qui doit être fait pour faire la réparation des mésappariements (substitutions)?
La réparation doit identifier l’erreur, identifier le brin qui contient l’erreur, corriger et tout cela très vite, avant la prochaine réplication.
26
Chez E.coli, comment se fait la méthylation de l’ADN?
o La méthyltransférase Dam reconnaît la séquence «GATC» sur l’ADN et y ajoute un groupe méthyl (CH3) sur l’adénine. Les «GATC» sont fréquentes (1/256 pb).
—> Avant la réplication, l’ADN parentale est méthylé.
o Lors de la réplication le brin matrice demeure méthylé et le nouveau brin ne l’est pas encore (la nouvelle molécule d’ADN db est hémi-méthylée).
o Ainsi, s’il y a une mutation ponctuelle la machinerie enzymatique reconnait le nouveau brin (celui sans CH3) et le corrige.
27
Chez E.coli, quel est le rôle des Mut (6 étapes)?
o La MutS parcourt l’ADN et détecte les distorsions de la charpente (causées par les mésappariements).
—> MutS s’y attache: induction d’un changement de conformation de la protéine et échange ADP → ATP.
—> Ainsi MutS recrute la protéine MutL.
o Ensemble, MutS-MutL vont glisser sur l’ADN pour chercher la MutH qui clive le brin d’ADN non-méthylé, ce qui met fin à la partie“mut”.
o Par la suite, une hélicase spécialisée (UvrD) s’attache au point de césure et ouvre l’ADN.
o Une exonucléase élimine les nts à partir de la césure et jusqu’au-delà du mésappariement.
—> Le tout est réparé par l’ADNpol I et la ligase.
28
Chez E.coli, quels sont les rôles de la MutH (2)?
o Peut couper du côté 3’ de l’erreur ou de 5’:
—> L’Exo VII ou Rec j dégradent le brin dans
la direction 5’-3’.
—> L’Exo I dégrade dans la direction 3’-5’.
o Se lie aux séquences GATC temporairement hémiméthylées suite à la réplication.
—> Reste sa forme inactive jusqu’à l’arrivée de MutS-L.
—> La MutH activée clive le brin d’ADN non méthylé au site –GATC-.
29
Chez E.coli, que permet l’activité exonucléase des polymérases?
L’activité exonucléase des polymérases permet d’améliorer la fidélité de réplication d’un facteur 100 et le système de réparation des mésappariements augmente encore cette fidélité par 1000
30
Chez les eucaryotes, quels sont les homologues de MutS et MutL? Recrutés par qui?
Homologues de MutS et MutL(chez humain MSH et MLH).
—> Recrutés par la PCNA (clamp euca).
—> Les eucaryotes semblent avoir dupliqué le gène MutS pour former des hétérodimères MSH. Les différentes sous-unités peuvent reconnaitre des mutations différentes.
31
Chez les eucaryotes, quel est l’homologue de MutH?
Pas d’homologue MutH.
—> À la place, une RNase H fait une coupure au niveau de l’amorce (cette enzyme reconnait un hybride ARN-ADN).
—> MutL se fixe par-dessus la coupure et les exonucléases enlèvent le fragment situé entre MutS et MutL.
—> Au lieu de RNase H, les exonucléases peuvent aussi utiliser les césures temporaires entre les fragments d’Okasaki ou le bout 3’ du brin avancé.
32
Vrai ou faux : Chez les eucaryotes comme chez les procaryotes, le mécanisme de la méthylation est utilisé.
Faux : Le mécanisme de la méthylation n’est pas utilisé chez les eucaryotes.
—> Les fragments d’Okazaki et l’amorce indiquent quel brin est «nouveau» (toute proportion gardée, il y a plus d’Okazaki chez les eucaryotes, car plus courts).
33
Définir microsatellites.
Les microsatellites sont des motifs de 2 à 10 nucléotides hautement répétés ex: CTTCTTTT ...
o Selon les séquences, possibilité d’appariement simple brin en ‘épingle’.
o Les enzymes de la réplication copient difficilement les microsatellites avec fidélité et effectuent des ‘dérapages’ : Augmentation ou diminution du nombre des répétitions présentes
* Polymorphisme.
34
Définir mécanisme de glissement réplicatif.
Mécanisme de glissement réplicatif : les insertions ou les délétions apparaissent par un "appariement décalé" de séquences répétées.
35
Chez les eucaryotes, qui détecte les dérapages de polymérase et les corrige? Sans réparation, que se passerait-il?
Le système Mut-homologue des eucaryotes détecte les dérapages de polymérase et les corrige.
—> Sans réparation, certaines pathologies peuvent apparaître. Elles sont associées à l’expansion des
triplets répétés à l’intérieur des gènes.
36
Expliquer la maladie de Huntington (neurodégénérescence).
Un microsatellite «CAG» dans le gène HD qui code la protéine HTT (CAG = codon glutamine)
—> une élongation de la HTT par ajout de plusieurs glutamines. Les individus sains ont 10-26 répétitions du triplet. Les porteurs de la maladie ont 40+ répétitions. La maladie est génétiquement dominante et le nombre de répétitions tend à augmenter d’une génération à l’autre.
37
Qu’est-ce que HTT? Quel est son rôle?
HTT est un facteur de transcription qui régule l’expression d’un récepteur de neurotransmetteur dans les neurones. Il utilise ses glutamines pour interagir avec la machinerie de transcription donc leur nombre est importan
38
Quel est la conséquence d’une protéine HTT avec plus de glutamines? Quels sont les effets de cette conséquence (3)?
La protéine HTT avec plus de glutamines se replie mal, et n’a donc pas la bonne configuration.
Modifie le niveau d’expression de gènes impliqués dans :
•la réception de neurotransmetteurs
•la signalisation intracellulaire
Agrégation des protéines dans la cellule, affectant son fonctionnement normal
•Formation de ponts H entre les protéines mutantes HTT
•Provoque un détachement de la dynéine des microtubules → mauvaise conduction des vésicules
Clivage protéolytique des protéines mutantes (bris en plusieurs morceaux non fonctionnels)
•Les morceaux clivés de HTT sont importés dans le noyau
•Induit la mort cellulaire des neurones
39
Que sont les altérations spontanées et quand surviennent-elles?
Plusieurs modifications chimiques des bases surviennent spontanément en présence d’eau et peuvent entraîner des altérations dans la séquence d’ADN.
—> Altérations spontanées = altérations hydrolytiques
40
Quels sont les types d’altérations spontanées (2)?
La déamination (perte d’un NH3)
La dépurination (coupure du lien glycosidique reliant purine-sucre)
—> un site apurique (AP) (b)
41
Quels sont les 2 cas fréquents de la déamination?
*2 cas fréquents:
-La cytosine devient uracile(a)
-La cytosine-CH3 devient thymine (c)
—> La méthylation de C est un mécanisme répandu de l’inhibition transcriptionnelle chez les vertébrés
—> Altération la plus fréquente chez l’humain. Vitesse de déamination de la cytosine = indicateur de la vitesse de la perte d’information génétique
42
Vrai ou faux : Les altérations chimiques ne peuvent pas être provoquées par des facteurs environnementaux.
Faux : Les altérations chimiques peuvent également être provoquées par les facteurs environnementaux.
43
Quels sont les facteurs environnementaux qui peuvent provoquer des altérations chimiques (2)?
o les substances mutagènes (agents chimiques qui augmentent le taux de mutations)
o les radiations.
44
Quels sont les différents mécanismes de mutagènes (4)?
o Alkylation : ajout de gr.chimiques sur les bases Résultat: mésappariement/pas d’appariement.
Ex: G + CH3= incapacité à faire des liens H
o Oxydation : ajout d’un “O” ou perte d’un “H”.
Résultat: un mésappariement.
Ex: Oxo-G fait un lien avec A.
—> Une des mutations les plus communes dans le cancer humain.
o Analogue de base : une autre molécule remplace une base et l'appariement se fait selon la molécule ajoutée.
o Agent intercalant : une molécule s’insère entre les bases (intervient dans réplication/transcription).
45
Quelles sont les altérations chimiques provoquées par les radiations (2)?
o Les rayons UV : la lumière proche de 260nm (ondes) est fortement absorbée par les bases. Cela cause la fusion photochimique de deux pyrimidines adjacentes sur le même brin (formation d’anneau cyclobutane entre T et T).
—> Ces dimères sont impossibles à apparier et provoquent l’arrêt de la polymérase.
o Les radiations ionisantes (rayons γ et X)
—> directement, en s’attaquant au sucre (désoxyribose) : cassure double brin de l’ADN (DSB),
—> Indirectement en favorisant l’apparition des radicaux libres (agents oxydants: O2-, H2O2, OH•).
46
Quels sont les systèmes de réparation des altérations chimiques des bases spontannées et environnementales (5)? Expliquer chacun.
o L’inversion directe (la « vraie » réparation): reconnaitre la base modifiée (enzymes différentes pour chaque type d’altération) et défaire l’altération pour revenir à une base normale.
o La réparation par excision d’une base: reconnaître la base modifiée (enzymes différentes pour chaque type d’altération), l’enlever (site AP) et la remplacer par une autre.
o La réparation par excision d’un fragment d’ADN sb: reconnaitre la distorsion dans l’hélice (mêmes enzymes pour plusieurs types d’altérations),enlever une partie d’un brin dans la région de la déformation et combler la brèche.
o La réparation par recombinaison homologue: utiliser la chromatide sœur pour reconstituer la bonne séquence.
o La réparation translésionnelle: l’altération n’a pas été réparée à temps et durant la réplication, une polymérase spécialisée réplique l’ADN sans respecter les appariements.
47
Quels sont les systèmes de réparation qui utilisent 1 brin altéré et l’autre sert de matrice pour la réparation?
- La réparation par excision d’une base
- La réparation par excision d’un fragment d’ADN sb
48
Quels sont les systèmes de réparation qui utilisent 2 brins altérés ou cassés?
La réparation par recombinaison homologue
49
Qui permet les inversions directes des altérations?
Des enzymes spécialisées sont capables de reconnaître directement les bases altérées et de les «corriger».
50
Quelles sont les enzymes qui permettent les inversions directes des altérations (2)? Quels sont leurs rôles à chacune?
La photolyase (proca et euca):
o Reconnaît les dimères de pyrimidine (causés par UV) et se lie sur eux.
o Lors de l’exposition suivante à la lumière, elle clive l’anneau de cyclobutane.
La méthyltransférase (humain et souris) :
o Reconnaît G-CH3 (causé par une alkylation par un mutagène) et catalyse le transfert du CH3 de l’O6- méthylguanine vers une de ses cystéines.
o Réaction irréversible, l’enzyme ne peut pas être réutilisée.
51
Qu’est-ce que la Réparation par Excision d’une Base, la voie BER (proca et euca)? Qui?
Les ADN glycosylases parcourent l’ADN et analysent le sillon mineur.
Elles peuvent détecter une base altérée et/ou une base qui a été insérée par mésappariement avec une base altérée .Une enzyme spécifique par type d’altération (8 enzymes différentes identifiées chez l’humain).
52
Quelles sont les étapes de la réparation par excision d’une base (la voie BER) (3 étapes)?
1- Lorsqu’une base altérée est détectée, la glycosylase lui fait un «flip-out» (la sort de l’autre côté de la charpente) et clive son lien glycosidique. Cela donne un nucléotide apurique ou apyrimidique(AP).
2- L’endonucléase AP/exo enlève l’AP (2 coupures: endo en 5’ et exo en 3’).
3- L’ADN polymérase et l’ADN ligase peuvent ensuite réparer la brèche (besoin d’un brin intact comme matrice).
53
Quelles sont les étapes de la réparation par excision d’un fragment d’ADNsb (la voie NER) (3 étapes)?
Chez E. coli, les protéines Uvr:
1- Le complexe UvrA-UvrB parcourt l’ADN et lorsqu’une déformation d’hélice(différentes altérations et particulièrement celles dues aux UV) est détectée : le UvrA quitte le complexe.
2- UvrB peut alors séparer les deux brins et de recruter l’UvrC qui coupe le brin contenant une altération à 2 endroits : Le segment produit est dissocié par UvrD.
3- ADN pol et ADN ligase réparent la brèche en se servant du brin intact comme matrice.
* Même mécanisme chez les eucaryotes, mais avec 25 protéines différentes. Si ces protéines sont elles-mêmes mutées, le cancer de la peau se développe (UV!).
54
Quel est le principe de la réparation translésionnelle (proca + euca)?
Durant la réplication, lorsque la progression de la polymérase normale est bloquée par une altération non réparée, l’ADN polymérase translésionnelle réplique l’ADN sans respecter les appariements
—> Utilise la matrice que pour s’attacher(un processus forcément mutagène, mais mieux qu’une réplication incomplète du chromosome).
55
Vrai ou faux : Certaines polymérases translésionnelles sont spécifiques à un type d’altération et répliquent l’ADN correctement.
Vrai
56
Chez E.coli, comment est l’ADN polymérase translésionnelle?
Chez E. coli cette polymérase n’est pas présente tout le temps. Elle est synthétisée seulement lorsque la bactérie subit TROP de mutations (partie de la réponse SOS).
57
Les coupures db ne peuvent pas être réparées en utilisant un brin comme matrice. La réparation peut se faire via quoi (2)?
o Le mécanisme de la recombinaison homologue (HR)
o La ligature directe des extrémités non homologues
58
Comment se fait la voie HR (proca + euca)?
o Réalisée par les enzymes recombinases (Rad51,RecA).
o L’information perdue est récupérée de la deuxième copie du chromosome concerné (la chromatide sœur).
o Ce mécanisme n’est possible que si le chromosome a déjà été répliquée (phases S et G2) et la réparation est quasi à 100%.
—> On peut également se servir de la recombinaison si les deux brins ne sont pas cassés, mais altérés.
59
Ligature directe des extrémités non homologues est un mécanisme présent quand?
Un mécanisme présent durant tout le cycle cellulaire. Il aboutit souvent à la perte d’un fragment du chromosome (processus mutagène).
60
Quelles sont les étapes de la voie NHEF (non homologue end joining) (3)?
1- Après une cassure db, l’ADN est rapidement dégradé par les exonucléases.
2- Les protéines Ku70 et Ku80 reconnaissent la cassure et se lient par-dessus pour protéger l’ADN.
3- Elles recrutent les kinases (DNA-PKcs) qui rapprochent les extrémités d’ADN et activent une endonucléase Artemis.
—> Coupures franches(prépare les extrémités d’ADN) pour permettre la soudure par la suite (ligase IV).
61
Quelle voie se fait rarement chez les bactéries (on la voit presque seulement chez euca)?
La Voie NHEJ (non homologue end joining)
62
Vrai ou faux : La voie NHEJ est impliquée dans la production des anticorps.
VRai
63
Qu’est-ce que la recombinaison V(D)J?
Système de recombinaison des gènes codant les anticorps.
Des bris doubles brins sont induits intentionnellement selon un processus spécifique aux lymphocytes B (cellules productrices des anticorps).
La voie NHEJ permet ensuite de recombiner et réassocier des segments V, D et J de manière aléatoire : Large éventail de chaines lourdes et légères, qui reconnaîtront divers antig
64
Quels sont les intermédiaires entre les voies HR et NHEJ (2)?
o SSA (non conservative single-strandannealing)
o alt-NHEJ (alternative-NHEJ).
65
Les voies SSA et alt-NHEJ utilisent quoi pour fonctionner?
Ces voies utilisent les homologies trouvées à l’intérieur du chromosome cassé:
—> Les séquences répétées situées de part et d’autre de la cassure, sont complémentaires et s’hybrident ensemble. Ces processus impliquent une perte d’information.
66
Que sont les gènes suppresseurs de tumeurs? Dans quoi sont-ils impliqués?
Les protéines suppresseurs de tumeurs sont impliquées dans la protection du génome contre les cassures db d’ADN.
67
Nommer les gènes supresseurs de tumeurs importants chez l’humain (2)?
BRCA1/2 sont actifs lors de la réplication. Les mutations dans ces deux gènes augmentent de 50-80% les risques de développer un cancer du sein et 30-50% des ovaires.
68
Avec quoi interagissent les gènes suppresseurs de tumeurs (3)?
o Autres suppresseurs de tumeurs
o Protéines de réparation (voie HR et NHEJ)
o Régulateurs du cycle cellulaire
69
Que permet la recombinaison génétique?
Permet un échange génétique et/ou un réarrangement chromosomique.
70
Définir recombinaison homologue. Quand est-elle faite (2)?
Recombinaison homologue (“crossing over”) : un échange d’ADN entre deux chromosomes de la même paire, l’ordre des gènes est conservé:
—> Réparation de la cassure bicaténaire: entre 2 chromatides sœurs.
—> Méiose : entre 2 chromosomes homologues (1 maternel et 1 paternel)
71
Définir transposition.
Un réarrangement d’ADN par le déplacement d’un segment, l’ordre des gènes peut changer.
72
Que peuvent être les transposons (2)?
o Réplicatifs, ils se dupliquent, une copie est laissée derrière et la nouvelle copie s’intègre à une autre place dans le génome.
o Non réplicatifs, une seule copie voyage dans le génome).
73
Quelles sont les 3 classes principales de transposons?
o Transposons ADN (non réplicatifs)
o Rétrotransposons viraux (avec LTR) (intermédiaire ARN)
o Rétrotransposons non viraux (poly-A)
(intermédiaire ARN)
74
Quelles sont les 2 catégories majeures de transposition?
o Type I, ou rétroéléments, dont la mobilisation fait intervenir un intermédiaire ARN
o Type II, ou transposons à ADN, qui utilisent un intermédiaire ADN pour leur transposition.
75
Dans les transposons à ADN, la partie centrale du transposon code pour quoi?
Pour une transposase
76
Quels sont les rôles des autres gènes des transposons à ADN?
Régulation de la transposition, fonctions utiles
pour la transposition ou pour l’organisme.
77
Aux extrémités des transposons à ADN, que retrouve-t-on (2)?
—> 2 sites de recombinaison : 2 répétitions inversées TIR ayant un site de reconnaissance pour la transposase.
—> 2 répétitions directes (DRs, “target site duplications”): produits durant la transposition
78
Quelles sont les étapes du mécanisme de transposition (couper-coller) (6)?
1- Le gène «transposase» est transcrit et traduit.
2- La transposase reconnaît-lie les séquences inversées aux extrémités du transposon.
3- L’ADN est clivé par la transposase(entre les répétitions directes et inversées), la coupure génère les extrémités 3’OH.
4- Les 3’OH s’attaquent à l’ADN sur un nouveau site (à une distance de qqs nt l’un de l’autre): réaction de transestérification.
5- Le transposon s’insère à un nouveau site.
6- La réparation d’ADN s’occupe du reste.
79
Que veut dire LTR?
Longues répétitions terminales
80
Décrire les rétrotransposons avec LTR (3).
o Structure proche de celle des rétrovirus.
o Promoteur interne localisé dans le LTR en5’
o Transcrits en ARN par l’ARN Pol II.
81
Dans un rétrotransposon avec LTR, quels sont les gènes retrouvés (3)?
o Entre les deux LTRs situés aux extrémités 5’ et 3’:
- Le gène Gag code pour une pseudo-particule virale (Virus-like particles, VLP) dans laquelle la transcription inverse a lieu.
- Le gène Pol code pour plusieurs fonctions enzymatiques : une protéase permettant de couper les polyprotéines en plusieurs segments, une transcriptase inverse (avec un domaine ribonucléase H à l'extrémité C-terminale) qui permet de transcrire l’ARN en ADN complémentaire et enfin une intégrase qui permet l’intégration du segment d’ADN produit dans le génome hôte
- Le gène Env code pour des protéines d’enveloppe.
82
Les rétrotransposons viraux possèdent 2 LTR qui contiennent quoi (3)?
2 LTR –“long terminal repeat” (sites de recombinaison) avec des segments fonctionnellement distincts
- U3 (unique 3’, contient un promoteur),
- R permettant les “sauts” d’amorces (R -repeat) et
- U5
83
En bref, comment est la structure des rétrotransposons viraux?
Répétition directe (“target site duplications”): duplication courte de site cible flanquant les insertions de rétrotransposons LTR..
LTR (U3, R, U5)
Région codante (gène Gag, Pol, Env)
LTR (U3, R, U5)
Répétition directe
84
Comment se fait le mécanisme de rétrotransposition avec LTR (7 étapes)?
1- Les gènes «transcriptase inverse » et «intégrase» sont exprimés.
2- Un nouvel ARNm du transposon est généré et intercepté par la
rétrotranscriptase.
3- La rétrotranscriptase utilise cet ARN comme matrice pour produire un cADN.
4- Le cADN est reconnu par l’intégrase. Elle le clive un peu pour générer les bouts 3’OH «en escalier».
5- Les 3’OH s’attaquent à l’ADN sur un nouveau site (à une distance de qqs nt l’un de l’autre): réaction de transestérification.
6- Le transposon s’insère à un nouveau site.
7- La réparation d’ADN s’occupe du reste, cela génère les répétitions directes aux bouts.
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Que contiennent les rétrotransposons non viraux (poly-A)?
Génome humain : transposons “LINE” (Longs éléments nucléaires intercalés)
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Qu’est-ce qui compose un rétrotransposon non viraux sans LTR (6)?
o Deux cadres de lecture:
—> Un gène codant ORF1: une protéine (RBP) capable de lier ARN.
—> Un gène codant ORF2: une protéine à la fois transcriptase inverse (RT) et endonucléase.
o Une séquence 5’UTR : un site contenant un promoteur à son 1er nt.
o Une séquence 3’UTR : avec un signal de polyadénylation (AATAAA) suivi de (A)n).
o 2 répétitions directes (“target site duplications”) : produits durant la transposition.
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Quel est le mécanisme de rétrotransposition sans LTR (7 étapes)?
1- Les gènes «ORF1» et «ORF2» sont transcrits, traduits et restent attachés à leur ARNm.
2- Le complexORF1-2-ARN retourne au noyau.
3- Le complexe ARNm-protéines se lie à un site riche en T de l’ADN cible et y fait une coupure: le 3’OH obtenu lui servira d’amorce pour la rétrotranscription de l’ARN.
4- Au début de la rétrotranscription, le tout est stabilisé par l’hybridation produite (l’appariement entre la région Poly-A de l’ARN et la séquence poly-T de l’ADN).
5- L’ARN est rétrotranscrit en cADN = 1brin ADN.
6- Génération du 2ième brin d’ADN et l’intégration du bout non-attaché
dans le génome.
7- La réparation d’ADN génère les répétitions directes aux bouts.
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Quels sont les 2 types de rétrotransposons sans LTR?
o Les LINEs contiennent tout le matériel génétique nécessaire à la production de leurs enzymes de rétrotransposition
—> Longs éléments nucléaires intercalés (Long interspersed nuclear elements, LINEs)
o Les SINEs ne codent aucune enzyme. Ces derniers parasitent en fait la machinerie des LINEs
—> Petits éléments nucléaires intercalés (Short interspersed nuclear elements, SINEs)
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Quelles sont les 3 catégories des transposons?
“ADN”, “LTR” et “poly-A”.
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Vrai ou faux : La transposition est la source majeure de mutations, et près de la moitié du génome humain est composée de séquences dérivées d’éléments transposables.
Vrai
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Les génomes des organismes complexes contiennent beaucoup de transposons ou éléments similaires (quantité variable selon organisme). Qu’est-ce que cela indique?
Leur persistance (et augmentation )au sein du génome, indique une sélection favorable par l’évolution.
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Que contient le gène codant une enzyme de la voie de synthèse d’anthocyanin(pigment)? Qu’est-ce que cela permet?
Le gène codant une enzyme de la voie de synthèse d’anthocyanin(pigment) contient un transposon (TE).
—> La présence du transposon empêche la transcription : la graine a un phénotype « jaune ».
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Quand la graine a-t-elle un phénotype brun (cellule germinale) ou taches brunes (cellule somatique)?
Si le transposon se déplace, la transcription se fait, l’enzyme est produite et l’anthocyanin est synthétisé
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Durant l’intégration des transposons dans l’ADN génomique, que peuvent-ils faire (3)?
o Ils peuvent interrompre les gènes (ex.maïs) ou les régions régulatrices des gènes.
o Ils peuvent devenir des introns
o Ils peuvent entrainer le déplacement d’autres éléments génomiques (a et b).
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Qui est une source importante de mutations?
Les transposons sont une source importante de mutations.
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Vrai ou faux : Les transposons peuvent également participer lors la recombinaison homologue de la méiose ou de la réparation de type HR.
Vrai : Le mécanisme de la recombinaison homologue est guidé par les gènes ayant les mêmes séquences...
Mais, la présence de séquences similaires ou identiques à plusieurs endroits sur le génome augmente les risques de recombinaison entre des chromosomes non homologues (non-allélique) ou un enjambement inégal sur le même chromosome avec des sections mal appariées d’un gène., ce qui résulte en des duplications ou des délétions importantes.
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Comment se fait la recombinaison homologue non-allélique?
La recombinaison se fait entre 2 régions d’ADN n’ayant pas les mêmes gènes (peut- être même 2 chromosomes de type différents), mais qui ont les mêmes transposons.
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Pour étudier un gène particulier ou un segment défini d’un ADN chromosomique, qu’est-ce qui doit être fait?
Pour étudier un gène particulier ou un segment défini d’un ADN chromosomique, la longue molécule d’ADN doit d’abord être coupée en fragments d’une taille exploitable.
—> endonucléases de restriction.
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Que sont capables de faire les enzymes de restriction?
Ces enzymes sont capables de reconnaître une séquence spécifique d’ADN, site de restriction, et de la cliver (coupure db).
—> Ciseaux moléculaires
100
D’où proviennent les enzymes de restriction?
Proviennent des bactéries qui les utilisent pour éliminer (restreindre) tout ADN étranger.
—> Leur ADN est protégé par la méthylation (ajout du CH3 par une méthylase) sur les sites de restriction.
—> Un site de restriction est spécifique à une enzyme donnée.
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Les noms des enzymes de restriction font référence à quoi?
Les noms des enzymes de restriction font référence à l’organisme duquel elles ont été isolées.
102
Les sites de restriction sont composés de quoi?
Composés de 4 à 8 nucléotides et la plupart sont des palindromes
103
Vrai ou faux : Les sites de restriction étant très longs, ils ont de fortes chances d’être présents qu’une ou deux fois dans un génome.
Faux : Les sites de restriction étant très courts, ils ont de fortes chances d’être présents plusieurs fois dans un génome.
104
La coupure produite par les enzymes de restriction est double brin et peut être de 2 types, quels sont-ils?
La coupure produite par les enzymes de restriction est double brin et peut être de 2 types: franche ou cohésive
105
Que produisent les coupures cohésives?
Les coupures cohésives produisent des extrémités libres compatibles entre elles et cela facilite leur soudure (stabilisation des fragments par les liens H augmente l’efficacité de la ligation 100X).
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Quelles sont les deux possibilités pour souder deux molécules d’ADN (A et B) ensemble?
1) Utiliser la même enzyme de restriction sur chaque molécule. Lors de la soudure, le site de restriction est reproduit.
2) Utiliser 2 enzymes différentes, qui produisent des extrémités compatibles. Lors de la soudure, le site de restriction n’est pas reproduit.
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Qui assure le clonage directionnel? Qu’est-ce que c’est?
Les extrémités cohésives assurent aussi un clonage directionnel: l’incorporation du fragment doit suivre les règles d’appariements des nucléotides et est possible dans une direction seulement.
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Clonage non directionnel vs directionnel
Clonage non directionnel : Utilisation de la même enzyme de restriction = le promoteur pourrait se trouver à la fin du gène
Clonage directionnel : Utilisation de 2 enzymes de restriction sur chacune des molécules à unir = une seule possibilité pour la ligation = le promoteur et le gène sont correctement alignés
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Qui permet de faire la ligation de coupures? Quelles liaisons sont formées?
Les ligases sont utilisées pour catalyser l’insertion de fragments (coupés par les enzymes de restriction) à l’intérieur d’un vecteur (ex. plasmide).
Elles forment les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides.
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Quelles sont les techniques qui permettent la visualisation des fragments de restrictions (3)?
o Séparation des fragments par électrophorèse.
o Migration de l’ADN dans un gel d’agarose, qui agit comme un tamis moléculaire
o Séparation des fragments selon la longueur : Plus les molécules d’ADN sont longues, plus elles migrent lentement.
—> Une bande = fragments de même longueur
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Définir agarose
polysaccharide formant un long polymère sous forme d’hélice. Lorsque solidifiées, ces fibres forment un maillage tridimensionnel
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La distance parcourue par la molécule d’ADN est ________ proportionnelle à sa longueur.
inversement
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Pour visualiser l’ADN sur le gel, qu’est-ce qu’on utilise?
Pour visualiser l’ADN sur le gel, on utilise des composés tel le bromure d’éthidium, capable de s’intercaler entre les bases de la double hélice. Lorsqu’il est exposé à des UV, il devient fluorescent.
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Définir cartographie de restriction.
Un ADN coupé par une enzyme de restriction donne toujours les mêmes fragments de restriction ( sauf si mutation au niveau du site de restriction).
