La réplication de l’ADN Flashcards
Quelles sont les 4 phases de la division cellulaire eucaryote?
Interphase :
1- Phase G1
2- Phase S (réplication d’ADN)
3- Phase G2
*Ne fait pas partie de l’interphase
4- Phase M (mitose + citokinèse)
Durant le cycle de division cellulaire, quels sont les changements majeurs que subissent le noyau et l’ADN (3)?
Durant le CDC, le noyau subit des changements majeurs ainsi que l’ADN qu’il contient:
- la disparition-reconstruction du noyau,
- la réplication et la condensation d’ADN en chromosomes mitotiques,
- la séparation des chromatides sœurs.
Quelles sont les 5 phases de la mitose?
1- Prophase
2- Prométaphase
3- Métaphase
4- Anaphase (fait aussi partie de la citokinèse)
5- Télophase (fait aussi partie de la citokinèse)
Qu’est-ce qui caractérise la prophase?
Condensation des chromosomes (positionnement des condensines)
Qu’est-ce qui caractérise la prométaphase?
Disparition du noyau
Qu’est-ce qui caractérise la métaphase?
Alignement des chromosomes : formation de la plaque équatoriale
Qu’est-ce qui caractérise l’anaphase?
Chromatides sœurs se séparent (détachement des cohésines)
Qu’est-ce qui caractérise la télophase?
Décondensation d’ADN (détachement des condensines et reconstruction nucléaire)
Quels sont les checkpoints du cycle cellulaire eucaryote (3)?
G1/S : L’environnement est-il favorable
G2/S : Est-ce que tout l’ADN est répliqué ? Tous les dommages à l’ADN sont-ils réparés ?
M : Tous les chromosomes sont-ils correctement attachés au fuseau mitotique
Quels sont les signaux du cycle cellulaire (2)?
Cdk (cycline dependant kinase) et cyclines
À quoi sert la double hélice d’ADN?
La double hélice d’ADN sert de matrice pour sa propre réplication: les nucléotides d’un “nouveau” brin sont insérés selon la complémentarité des bases avec le “vieux” brin – brin matrice.
—> Il est nécessaire d’ouvrir la double hélice initiale pour rendre accessibles ses 2 brins à la réplication.
Où doit se faire l’ouverture de la double hélice d’ADN?
L’ouverture doit se faire dans les régions spécifiques, appelées origines de réplication (ORI).
—> Un organisme peut avoir une seule ORI par chromosome (procaryote) ou plusieurs (eucaryote).
Comment sont les origines de réplication chez la levure vs l’humain?
Chez certains organismes, comme la levure, les ORIs sont des séquences précises (toujours les mêmes) riches en AT.
D’autres organismes dont l’humain, ne possèdent pas de séquence consensus (tous les ORI sont différents).
Vrai ou faux : Un chromosome peut avoir plusieurs ORIs ce qui augmente le temps nécessaire pour la réplication.
Faux : Un chromosome peut avoir plusieurs ORIs ce qui réduit le temps nécessaire pour la réplication.
Dans quelle phase les ORIs s’ouvrent? À quoi ça donne naissance?
Durant la phase S, chaque ORI s’ouvre (séparation du double brin d’ADN) et donne naissance à 2 fourches de réplication où travaillent plusieurs protéines responsables de la réplication.
Comment sont les chromosomes d’un procaryote vs eucaryote?
Chromosome procaryote = circulaire
Chromosome eucaryote = linéaire
Qu’est-ce que la protéine initiatrice?
La protéine initiatrice est la seule protéine dans la réplication qui reconnait une séquence spécifique de bases pour se lier à l’ADN.
- Les autres utilisent plutôt des interactions protéine-protéine et la reconnaissance de la forme générale d’ADN.
Quelles sont les 3 fonctions de la protéine initiatrice?
o trouver et lier l’ORI
o recruter d’autres protéines nécessaires à la réplication (formation d’un complexe d’initiation, hélicases)
o chez certains organismes (procaryotes) ouvrir la double hélice de l’ORI
La protéine initiatrice recrute ____________ (enzymes spécialisées dans l’ouverture d’ADN).
2 hélicases
Définir réplicateur
Ensemble complet des séquences suffisantes pour permettre l’initiation de la réplication.
Définir origine de réplication
Le site spécifique où commencent la séparation des deux brins et la réplication (riche en A:T). L’ORI fait partie du réplicateur.
Expliquer l’ouverture de la double hélice chez les procaryotes (3 étapes).
o DnaA lie spécifiquement les sites 9-mère.
o Lorsque DnaA est liée à l’ATP, la protéine interagit aussi avec un site 13-mère, et ainsi permet la séparation de la double hélice et la libération de l’ADNsb.
o Par la suite, DnaA aide à positionner l’hélicase qui poursuivra la séparation du db d’ADN.
Chez les eucaryotes, le complexe de reconnaissance de l’origine de réplication (ORC) est un complexe de _______ protéines.
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Quelle est la différence entre la liaison d’ORC au réplicateur vs au DnaA?
La liaison d’ORC au réplicateur n’aboutit pas à la dénaturation de l’ADN adjacent (contrairement au DnaA).
Par quoi est marqué le passage de la phase G1 vers la phase S?
Le passage de la phase G1 vers la phase S est marqué par l’activation des kinases dépendantes de cycline (Cdk).
—> Niveau élevé jusqu’à la fin de la division cellulaire, qui assure le passage du complexe pré-réplicatifs (pré-RC) vers un complexe actif et empêche la formation de nouveau pré-RC au niveau des réplicateurs.
La reconnaissance de l’origine de réplication chez les eucaryotes ne passe pas nécessairement par une séquence spécifiquement reconnue, mais plutôt par des motifs structurels impliquant quoi (4)?
—> Des séquences riches en AT ou en ilots CpG,
—> Une structure d’ADN particulière,
—> Des régions libres de nucléosomes,
—> Des régions impliquées dans l’initiation de la transcription.
Vrai ou faux : Les ORI sont déclenchés tous en même temps.
Faux : Les ORI ne sont pas déclenchées en même temps : Complexification en fonction du développement et des stress.
Décrire l’hélicase
Enzyme hexamèrique en forme d’anneau qui entoure l’ADN simple brin et se déplace rapidement (1000 nt/sec) le long de la chaîne.
—> Son déplacement nécessite l’hydrolyse d’ATP et entraîne la séparation des brins.
—> Sa forme lui donne une haute processivité
Dans l’hélicase, à quoi servent ses sous-unités, ses boucles et son pore?
o Chaque sous-unité possède une boucle capable d’agripper la charpente d’un nucléotide (sucre-P).
o Ces boucles fonctionnent comme 6 mains tirant sur une corde main par-dessus main et obligeant l’ADN à passer dans le pore central.
o Ce pore est étroit et ne laisse passer qu’un brin d’ADN : force la séparation du double brin.
Que se passe-t-il lorsque l’hélicase ouvre la double-hélice?
Lorsque l’hélicase ouvre la double hélice, les protéines SSB (Single-Strand Binding proteins) s’attachent sur l’ADN monocaténaire tout en formant des liens entre elles (« cooperative binding » = consolidation).
Quelles sont les fonctions des protéines SSB (2)?
o stabilisent les 2 brins séparés de l’ADN matriciel jusqu’à la synthèse des nouveaux brins complémentaires.
o empêchent la formation d’épingles par appariement de nucléotides complémentaires dans le même brin d’ADN. La formation d’épingles bloquerait la réplication.
Quelle est la conséquence du travail de l’hélicase?
L’hélice d’ADN fait un tour chaque 10 pb. Lorsque l’hélicase travaille, un surenroulement de l’ADN intervient:
o L’enroulement supplémentaire d’ADN (“supercoils”) est une source de tension.
Que faire pour enlever la source de tension de surrenroulement de l’ADN?
o Les topoisomérases coupent et ressoudent le double brin pour enlever les supertours.
Quels sont les 2 types de topoisomérases et leur rôle?
o Topoisomérase I : coupe et ressoude un des brins d’ADN
o Topoisomérase II : coupe et ressoude les deux brins d’ADN
À chaque ORI il y a formation de quoi?
À chaque ORI il y a formation d’un “oeil” de réplication par des hélicases qui ouvrent la double hélice d’ADN (devant l’hélicase, se placent les topoisomérases et derrière l’hélicase, se fixent les SSB).
—> Une fourche de réplication à chaque extrémité d’un œil de réplication est le siège de l’élongation
des nouveaux brins d’ADN.
Par qui est catalysée la synthèse de l’ADN?
La synthèse de l’ADN est catalysée par une enzyme appelée ADN polymérase.
- Elle a besoin d’une amorce présentant un 3’-OH libre commencer la synthèse d’un brin de novo
Comment se fait la synthèse de l’amorce pour la synthèse de l’ADN (3 étapes) et par qui?
La primase (ARN polymérase) est responsable de la synthèse de l’amorce :
1- Elle ajoute de courtes séquences d’ARN (env.10nt) sur le brin matrice.
2- Ces séquences seront ensuite utilisées comme référence par l’ADN polymérase pour synthétiser le reste du fragment.
3- Les ribonucléotides de l’amorce seront ensuite remplacés par des désoxyribonucléotides.
Par quoi est reconnue l’amorce d’ARN créée?
Chaque amorce ARN créée est ensuite reconnue par le « sliding clamp loader » (chargeur de pince glissante) qui y installe un anneau coulissant et une ADN polymérase.
—> En présence d’ATP, le chargeur se lie à l’anneau et l’ouvre pour qu’il puisse le charger sur l’ADN. Après l’hydrolyse de l’ATP, il se dissocie du complexe. Enfin, l’ADN polymérase se lie à l’anneau et commence la réplication
Vrai ou faux : Le « sliding clamp loader » et l’ADN polymérase sont en compétition pour le site de liaison.
Vrai : Une fois lié à la polymérase, l’anneau ne peut pas être lié de nouveau par le « sliding clamp loader »
De quoi sont composés les clamps?
Les clamps sont composés de plusieurs sous-unités identiques assemblées en forme d’anneau. Le trou central est suffisamment grand pour encercler la double hélice sans y toucher.
Quelles sont les fonctions des clamps (2)?
—> lie l’ADN au niveau de l’amorce, s’associe ensuite avec la polymérase et glisse avec elle.
—> permet de maintenir l’ADN polymérase sur le brin matrice
Quelle est la différence entre l’absence et la présence d’anneau coulissant?
Absence d’anneau coulissant : ADN pol. se détache au bout de 20 à 100 pb et s’éloigne
Présence d’anneau coulissant : ADN pol. se détache encore, mais son association avec l’anneau coulissant l’empêche de s’éloigner. La processivité de la polymérase augmente.
Comment s’y prend l’ADN polymérase pour synthétiser le nouveau brin?
L’ADN polymérase synthétise le nouveau brin en ajoutant des desoxynucleosides-3-P complémentaires au brin matrice (dNTP). Ils sont toujours ajoutés à l’extrémité 3’ (OH) d’un nucléotide déjà en place (formation du lien phosphodiester).
- L’ADN pol a donc besoin d’une amorce.
L’ADN polymérase a besoin d’énergie pour ajouter des nucléotides pourquoi?
o La rupture du lien avec le premier P pour former le lien phosphodiester avec la chaîne naissante
o La rupture du lien dans le pyrophosphate libéré par la pyrophosphatase.
- Il s’agit d’un processus couplé et le total de l’énergie émise permet une réaction irréversible!
Qu’est-ce que l’exclusion stérique et que cause-t-elle?
Les ADN polymérases distinguent rNTP et dNTP:
Bien que les rNTPs soient présents dans les cellules à des concentrations environ dix fois plus élevées que celles des dNTPs, ils sont incorporés à un taux plus de 1 000 fois plus bas.
—>Cette discrimination est due à l’exclusion stérique des rNTPs du site actif de l’ADN polymérase
- Les rNTP possèdent un groupement 2’-OH qui n’a pas de place à l’intérieur de l’ADN polymérase
Définir sélectivité cinétique
Sélectivité cinétique: n’importe quel nouveau nt peut entrer dans l’ADN pol, mais seulement le nt qui arrive à faire un bon appariement avec le nt de la matrice est dans une bonne position pour permettre la catalyse de son P est alors adjacent à 3’-OH.
La forme de l’ADN pol ressemble à une main qui tient l’ADN avec 3 domaines, nommer ces 3 domaines.
o la paume : site catalytique et vérification de l’appariement via le sillon mineur (ralentissement si erreur)
o les doigts : plient l’ADN matrice pour exposer 1 nt à la fois et referment la main en cas du “bon” nt dans la paume
o le pouce : aide à tout retenir ensemble en s’attachant à la charpente sucre-P (cela joue un rôle dans la processivité de l’enzyme)
Le site catalytique de la paume est formé de quoi? Et qui permettent quoi (2)?
Le site catalytique de la paume est formé d’ions métalliques (Mg2+ et Zn2+) qui permettent:
1- de favoriser l’interaction entre l’amorce et le nouveau nt en préparant l’O à «l’attaque»
2- de stabiliser le pyrophosphate produit en neutralisant les charges négatives
Expliquer la haute processivité de l’ADN polymérase.
Cette enzyme ajoute 1000 nt/sec. Le nombre total des nt ajoutés avant qu’elle ne se détache (sa processivité) varie de quelques nt à 50 000 selon le type de la polymérase.
Quelle est l’étape limitante de la synthèse d’un nouveau brin?
L’étape limitante est l’attachement de la pol sur l’ADN et donc pour accélérer le processus il faut la retenir!
—> Le complexe Clamp aide à maintenir la polymérase sur le brin matrice. Le Clamp est mis sur l’ADN par la protéine de chargement « Clamp loader ».
Vrai ou faux : Il y a un taux d’erreurs modéré de l’ADN polymérase.
Faux : Taux d’erreurs bas de l’ADN pol :
* Les erreurs dans l’appariement de nt sont rares (1/100 000), mais elles existent!
Que permet l’activité exonucléase de l’ADN polymérase?
L’activité exonucléase permet à l’ADN polymérase d’éditer les séquences d’ADN. Lorsqu’un nucléotide incorrect est ajouté :
o la «paume»ralentit la catalyse (une moins bonne interaction avec le sillon mineur),
o la polymérase clive le nouveau lien et retire ce nucléotide.
—> Grâce à cela le taux d’erreurs passe de 1/100 000 à 1/10 000 000!
—> Le taux d’erreurs final est encore moindre (1/ 10 000 000 000) via la réparation
de l’ADN post réplicative.
Exonucléases vs endonucléases
Exonucléases: nucléases qui ne peuvent dégrader l’ADN qu’à partir d’une extrémité
Endonucléases: nucléases qui peuvent couper l’ADN en cours de chaîne.
Expliquer la différence entre la synthèse des 2 brins.
Un brin continu et discontinu par fourche: la conséquence d’un besoin en 3’-OH
Brin continu (directeur, brin de tête, précoce, avancé, leading strand) :
—>Brin qui peut être synthétisé en continu par l’ADN polymérase avec 1 amorce.
—> L’ADN pol avance en même temps et dans la même direction que la fourche de réplication.
Brin discontinu (brin de queue, tardif, retardé, en retard, lagging strand)
—> La polymérase se déplace sur le brin matrice 3’ → 5’, s’éloigne de la fourche en synthétisant un court fragment d’ADN = fragment d’Okazaki.
—> Au fur et à mesure que l’oeil de réplication s’agrandit, la synthèse d’un nouveau fragment démarre: plusieurs amorces.
Fragments d’Okazaki d’un procaryote vs eucaryote.
Procaryotes : longueur de 1000 à 2000 nucléotides
Eucaryotes : longueur de 100 à 200 nucléotides
Expliquer le remplacement de l’amorce d’ARN par l’ADN (4 étapes).
1- La RNase H dégrade les hybrides ARN/ADN : Elle retire tous les nucléotides de l’amorce, sauf le dernier (car elle ne peut couper que le lien entre 2 ribonucléotides)
2- Une exonucléase 5’ retire le dernier nucléotide
3- L’ADN polymérase peut combler la brèche
4- L’ADN ligase peut attacher ensemble deux fragments d’ADN en reformant une liaison phosphodiester entre deux nucléotides adjacents.
Quels sont les types d’ADN polymérase chez les procaryotes (2) et leurs rôles?
ADN polymérase I (ADN pol I) = Substitution des amorces ARN, réparation de l’ADN. Fonction exonucléase 5’
ADN polymérase III (ADN pol III) = Réplication du chromosome
Quels sont les types d’ADN polymérase chez les eucaryotes (3) et leurs rôles?
ADN pol δ = Synthèse du brin discontinu de l’ADN ; réparation par excision de nucléotides (NER) et réparation par excision de base (BER)
ADN pol ε = Synthèse du brin continu de l’ADN, NER et BER
ADN Pol α (primase) = Synthèse des amorces pendant la réplication de l’ADN
Définir holoenzyme
Terme général décrivant un complexe multiprotéique dans lequel une enzyme « noyau » est associée à des partenaires qui renforcent son activité.
Les ADN polymérases travaillant sur chacun des brins à polymériser sont associées entre elles via quoi?
Les ADN polymérases travaillant sur chacun des brins à polymériser sont associées entre elles via le complexe de réplication ou réplisome.
—> Le réplisome avance dans le sens de la fourche de réplication, malgré le caractère antiparallèle de l’ADN.
Qu’est-ce qui compose le réplisome?
L’holoenzyme + les autres protéines essentielles à la machinerie de réplication = réplisome
Expliquer la coordination des événements de synthèse d’ADN chez E. Coli.
2 ADN polymérases sont liées entre elles et forment un large complexe protéique nommé ADN pol III holoenzyme. Le brin discontinu est plié en boucle pour respecter la lecture de 3’ vers 5’ et la synthèse de 5’ vers 3’.
Décrire le réplisome chez E. Coli (3).
o Les 2 polymérases sont maintenues ensemble par le clamp-loader et ce dernier leur fournit les clamps au fur et à mesure.
o L’holoenzyme a des légères interactions avec l’hélicase : donne plus d’efficacité à l’hélicase (10x vitesse) et l’empêche de s’éloigner trop loin.
o L’hélicase à son tour a des interactions avec la primase : Ces interaction déterminent la taille des fragments d’Okazaki: si les interactions sont fortes
—> la primase fait les amorces souvent et les fragments d’Okazaki sont plus courts (et vice versa).
Que se passe-t-il une fois qu’un Okazaki a été complété par la polymérase?
Une fois qu’un Okazaki a été complété par la polymérase, elle se détache de son Clamp et le clamp libre accueille la Rnase H (elle enlève l’amorce) et les enzymes suivantes.
—> Une fois l’Okazaki a été ressoudé, le clamp-loader enlève le clamp de l’ADN.
Chez E. coli, action coordonnée de combien de polymérases?
Chez E. coli, action coordonnée de 2 ou 3 polymérases (selon les modèles) sur le brin continu et le brin discontinu.
Expliquer la suite d’événements du réplisome chez E.coli (4 étapes).
o Le brin discontinu forme une boucle d’ADNsb (recouverte par les SSB).
o Les polymérases peuvent donc travailler de manière coordonnée sur les deux brins antiparallèles.
o Quand l’ADN polymérase du brin discontinu termine la synthèse d’un fragment d’Okazaki (elle touche l’amorce du fragment précédent), elle se détache de sa matrice.
o Elle reste toutefois toujours associée au réplisome et peut débuter la synthèse d’un nouveau fragment rapidement.
Comment se fait la coordination des évènements chez les eucaryotes?
o Les mêmes fonctions sont remplies par une plus grande variété de protéines et de complexes.
o Les modifications post-traductionnelles (Cdk) dépendantes du cycle cellulaire assurent l’assemblage du réplisome.
—> 3 polymérases distinctes : Pol α, Pol δ, Pol ε
—> Complexe protéique distinct du clamp loader assurant le maintien du réplisome.
—> Clamp loader éjecté du complexe suite à l’association de l’anneau et de l’ADN.
Chez les eucaryotes, que subissent les nucléosomes? Les anciens vs les nouveaux?
Les nucléosomes se réassemblent (les anciens) et s’assemblent (les nouveaux) aussitôt que la réplication produit des nouveaux brins.
o Les «anciens»nucléosomes sont partagés entre 2 nouveaux brins («distributive inheritence»).
o Les «nouveaux»nucléosomes sont recrutés par le clamp (indique un nouvel ADN) et s’assemblent entre les «vieux» à partir des intermédiaires solubles.
Que permet la conservation des « anciens » nucléosomes?
La conservation des “anciens” nucléosomes permet de maintenir l’identité de la cellule.
Que nécessite le passage de la machinerie de réplication?
Le passage de la machinerie de réplication nécessite un désassemblage partiel des nucléosomes.
Comment se fait le désassemblage partiel des nucléosomes (2)?
o Les H3-H4 tétramères restent attachés et transfèrent sur un nouvel ADN après la réplication. Ils sont distribués de manière aléatoire entre les deux chromatides sœurs (mais une distribution conservative a été observée également).
o Les dimères H2A-H2B quittent et se réassemblent après la réplication. Ils sont en compétition avec les “nouveaux”.
Vrai ou faux : L’ « ancien » H3-H4 tétramère reste attaché au réplisome et non à l’ADN directement.
Vrai
Que font les protéines chaperonnes d’histones (Asf1, FACT) lors du passage de la machinerie de réplication?
Les protéines chaperonnes d’histones (Asf1, FACT) s’associent à l’hélicase (MCM). Elles gardent les histones lorsque la machinerie de la réplication passe et ensuite, elles les transfèrent sur le nouvel ADN db.
Que font les H3-H4 tétramère vs les H2A-H2B lors du passage de la machinerie de réplication?
Le H3-H4 tétramère garde sa place initiale (se retrouve sur la même séquence d’ADN qu’avant la réplication), alors que le H2A-H2B se retrouve déplacé légèrement (dans les nucléosomes voisins).
Comment se fait la séparation des chromosomes circulaires chez les procaryotes?
Quand la réplication d’un chromosome circulaire est terminée, les deux molécules filles restent liées comme deux maillons d’une chaîne.
La séparation est assurée par une ADN topoisomérase de type II. Cette enzyme a la capacité de couper l’ADN db et de passer une deuxième molécule d’ADN db à travers cette coupure.
—> Cette réaction permet de séparer les deux chromosomes et de rendre leur ségrégation possible.
Vrai ou faux : Les topoisomérases sont nécessaires seulement chez les procaryotes.
Faux : Les topoisomérases sont aussi nécessaires chez les eucaryotes
Pour quoi sont utilisées les topoisomérases chez les eucaryotes?
Les topoisomérases I et II sont utilisées pour réduire la tension formée par l’avancée des fourches de réplication.
- La convergence des fourches de réplication forme des caténanes qui doivent être résolues.
Quel est le problème chez les eucaryotes lors de la réplication des bouts de chromosomes linaires? Que peut être la solution?
Comme les ADN polymérases ont besoin d’une amorce, l’extrémité 3’ d’un chromosome linéaire ne peut pas être répliqué.
—> La dernière amorce sur le brin discontinu est excisée et la polymérase n’a pas de 3’OH nécessaire pour combler le vide.
—> Il en résulterait un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire.
—> La solution réside dans les enzymes télomérases. Elles sont actives dans les cellules souches et dans les cellules germinales.
Définir télomérase
Une polymérase qui contient un ARN. Elle utilise sa partie ARN comme matrice pour allonger l’extrémité 3’ des chromosomes.
Expliquer le mode de fonctionnement de la télomérase.
Elle ajoute des nucléotides en 3’ d’un brin en formation. Elle fait des séquences répétitives (télomères) complémentaires à sa propre matrice.
—> Les télomères rallongent le bout 3’ et cet espace sert à faire un autre fragment Okazaki sur le brin 5’.
—> Le bout 3’ qui dépasse est protégé par une protéine ou il fait une boucle pour se « cacher ».
Qu’est-ce qu’une boucle de rétrocontrôle négatif?
Plus le télomère est long, moins la télomérase est active
Comment les télomères sont reconnus?
o Les télomères humains sont composés de la répétition TTAGGG.
o La séquence répétée en double brin est reconnue par la protéine TRF2 qui assure le positionnement du complexe shelterin (protéines TIN2, TRF1, RAP1, TPP1).
o La protéine protectrice des télomères (POT1) peut alors lier la séquence simple brin et assure, en partie, la formation de la T-loop.
- Permet de faire la différence avec un bris d’ADN et évite la réparation.
Que se passe-t-il sans l’action des télomérases?
Sans l’action de télomérases, on assiste à un raccourcissement progressif du chromosome à chaque génération cellulaire (vieillissement cellulaire).
Où les téomérases sont-elles actives?
—> Les télomérases sont actives dans les cellules souches et dans les cellules germinales.
—> Leur « activité » est programmée et change au fur et à mesure du développement. Ainsi, les cellules souches ont une limite de multiplication, au-delà de laquelle, les télomérases sont désactivées.
Quels sont les défis du séquençage (4)?
o Savoir « comment » (la méthode Sangeretal.,1977)
o Obtenir l’ADN sous forme manipulable, en petits morceaux (banques génomiques)
o Capacité de grande échelle (automatisation)
o Assembler et annoter les données (bio-informatique)
Expliquer la méthode de Sanger (5 étapes)
1- Besoin de séquencer seulement 1 brin: dénaturation de l’ADN et le brin gardé devient le brin matrice. (L’ADN est extrait de plusieurs cellules, vous avez donc beaucoup de brins matrices)
2- Production d’1 amorce connue et radiomarquée (on en produit beaucoup) qui va être utilisée tout le long de l’expérience.
3- À partir de la jonction amorce-matrice l’ADN polymérase réplique l’ADN.
4- La réplication est arrêtée avec 1 ddNTP spécifique connu.
5- On recommence les étapes 3 et 4 plusieurs fois, toujours à partir de la même amorce et en arrêtant la réaction avec différents ddNTP.
Selon la méthode de Sanger, comment se fait la séparation de l’échantillon ainsi que la dénaturation et séparation de l’ADN?
- Séparation de l’échantillon en 4 tubes selon quel ddNTP est utilisé pour arrêter la réaction: ddATP, ddTTP, ddCTP ou ddGTP.
—> Dans chaque tube, on ajoute l’ADN polymérase et des dNTP normaux pour un court laps de temps.
o Arrête la réaction avec ddNTP selon le tube.
o Dénaturation et séparation par électrophorèse (la migration des fragments sur un gel grâce au courant électrique, comme dans le Southern).
o Pour pouvoir observer les fragments, des amorces radiomarquées ou des ddNTP fluorescents peuvent être utilisés.
Que permet l’électrophorèse sur les 4 tubes selon la méthode de Sanger?
L’électrophorèse sur les 4 tubes nous permet de reconstituer la séquence (le brin complémentaire à la matrice)
Comment se fait la construction d’une banque génomique (3)?
Construction d’une banque génomique:
1- L’ADN est isolé et fragmenté (coupé par des enzymes de restriction).
2- Les fragments sont insérés dans un vecteur plasmidique.
3- Les vecteurs sont transformés dans des bactéries (pour les multiplier de façon indépendante, clones).
Pour la technique d’automatisation, deux améliorations de la technique ont permis la construction de Séquenceurs (Sequenator), quelles sont-elles? Quel en ai le résultat?
o séparation des fragments d’ADN par une chromatographie sur colonne (dans un mince capillaire: les fragments les plus petits se déplacent plus rapidement et passent au détecteur en premier, toujours 1 fragment à la fois) au lieu d’électrophorèse.
o Les ddNTP sont remplacés par ddNTP fluorescents.
- Résultat: les fragments polymérisés sortent de la colonne commençant par le plus petit et chaque fragment émet une couleur différente selon ddNTP-fluo (le détecteur transmet l’amplitude de chaque fluorochrome).
Quelle est l’étape finale du séquençage?
Une fois les fragments du génome ont été séquencés (et on s’assure que tout est là en séquençant 10X plus d’ADN que le génome contient: construction de 10 banques génomiques en utilisant des enzymes de restriction différentes), l’étape suivante est l’assemblage.
Durant l’assemblage, que permettent es séquences superposées?
Durant l’assemblage les séquences superposées permettent de déterminer l’ordre dans lequel les fragments doivent être placés
- La présence de régions répétées dans le génome rend le processus difficile.
Qu’est-ce que la PCR?
La PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) est utilisée pour produire une grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise, à l’aide d’une ADN polymérase.
—> Cette séquence est délimitée par les amorces utilisées.
Expliquer comment se fait la PCR (3 étapes).
Une version simplifiée de la réplication naturelle de l’ADN:
1- Le db est ouvert au complet par la dénaturation à une haute température
2- Les amorces (synthétisées d’avance) sont hybridées à l’ADN à une température plus basse
3- L’ADN pol utilisée est résistante aux hautes températures et son optimum se situe au-dessus de la température d’hybridation et en-dessous de celle de la dénaturation (Taq polymérase: isolée de la bactérie Thermus aquaticus).
—> Il faut ajouter les dNTP dans le mélange.
—> Les variations de température sont contrôlées par un thermocycleur.
Vrai ou faux : Pour la PCR, le choix des amorces importe peu.
Faux : Le choix des amorces est déterminant!
Il faut concevoir deux amorces complémentaires à chaque bout 3’ de la séquence visée.
Dans la PCR, à quoi servent les brins d’ADN nouvellement formés?
Les brins d’ADN nouvellement formés deviennent à leur tour ADN matrice et permettent l’augmentation exponentielle du nombre de produits (amplicons)
Le terme « produits » du PCR fait référence à quoi?
Le terme “produits” du PCR fait référence aux molécules finales délimitées par les amorces.
- À partir de 5 cycles d’amplification, elles représentent la majorité des molécules synthétisées.
Le nombre de produits dépend de quoi (3)?
Le nombre de produits dépend :
o du nombre de cycles (n),
o du nombre de molécules initiales d’ADN servant de matrice (x)
o de la quantité de réactifs (dNTP, amorces, enzymes).
—> Dans les conditions optimales: (2n -2n)x.
Quelles sont les applications de la PCR (1)?
Production des sondes pour les Southern et Northern (dans ce cas les dNTP utilisés durant la polymérisation peuvent être radiomarqués ou fluorescents)
Quelles sont les applications de la PCR + séquençage (3)?
- Identification de polymorphisme (allèles)
- Diagnostique d’infections
- Diagnostiques anténataux
Expliquer l’identification de polymorphismes (allèles) à l’aide de la PCR + séquençage.
Il existe plusieurs variantes d’un même gène dans une population d’individus. En amplifiant le gène d’intérêt et en le séquençant, il est possible d’identifier quelle allèle particulière porte un individu donné. Les polymorphismes sont utilisés pour identifier les criminels en comparant la séquence trouvée sur la scène du crime et la séquence homologue provenant d’un suspect. Les tests de paternité reposent sur le même principe.
Expliquer le diagnostique d’infections à l’aide de la PCR + séquençage.
l’ADN trouvé dans un échantillon provenant d’un malade est amplifié avec des amorces spécifiques pour des gènes viraux ou bactériens. Cette amplification permet de détecter la présence du parasite. Par la suite, il est possible de l’identifier via le séquençage.
Expliquer les diagnostiques anténataux à l’aide de la PCR + séquençage.
Un échantillon d’ADN du fœtus est prélevé, les séquences clés sont amplifiées et analysées (détection des maladies héréditaires ou des anomalies chromosomiques).
Quelles sont les applications de la PCR + hybridation avec une sonde marquée (1)?
Recherche de séquences spécifiques dans les échantillons ayant peu d’ADN (non détectable sans PCR)
Quelles sont les applications de la RT + PCR + électrophorèse ou marquage (2)?
Expression génique : Les ARNm d’un organisme sont isolés et ensuite rétrotranscrits en ADN à l’aide d’une rétrotranscriptase (RT).
- RT-PCR = Qualitatif
- gPCR = Quantitatif
Expliquer les 2 types d’Expression génique (RT-PCR vs gPCR).
—> RT-PCR: Qualitatif. Permet de détecter l’expression de gènes dans différents tissus. Les produits de la PCR sont visualisés par électrophorèse et cela permet de déduire grossièrement le niveau d’expression du gène en comparaison à un contrôle (plus d’ARNm = plus de matrices pour la PCR = plus de produits PCR = bandes plus grosses dans l’électrophorèse).
—> qPCR : Quantitatif. Utilisation d’un marqueur fluorescent permettant de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel de manière beaucoup plus précise. L’obtention de la courbe d’amplification de la réaction de polymérisation permet d’obtenir une quantification absolue de la quantité initiale d’ADN. Aussi nommée PCR en temps réel.
Quelles sont les applications de la PCR + mutagenèse ou trasngenèse (3)?
o Le matériel amplifié est soumis aux agents mutagènes, cloné dans des vecteurs plasmidiques et réintroduit dans un organisme.
o Les amorces sont porteuses de mutation(s)(« site directed mutagenesis »)!
o Une séquence d’un organisme est amplifiée, clonée dans des vecteurs et le plasmide est introduit dans un autre organisme (OGM).
