Laboratorio 3 Flashcards
¿Qué es la transducción? ¿Cuántas hay?
La transducción se puede definir como el proceso de transferencia
genética desde una célula dadora a otra receptora mediada por partículas de
bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera. Existen dos etapas
principales:
1. Formación de la partícula fágica transductora: Un trozo de material genético de
la célula dadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápside de un
bacteriófago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos”
anómalos del ciclo normal del fago.
2. La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula
receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su
información.
La Transducción fue descubierta en 1951 por Joshua Lederberg y su colaborador
Norton Zinder, y este sistema de transferencia lateral de genes utiliza como vehículo
de traspaso de material genético a los virus que infectan a las bacterias: Los
Bacteriófagos.
La transducción puede ser tanto generalizada como especializada:
Describa la transducción generalizada
Es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier
gen bacteriano de la bacteria dadora puede ser transferido a la célula receptora. Los
fagos que median la transducción generalizada normalmente cortan el DNA de la
célula hospedera en pequeñas piezas y empacan ambos ADNs al interior de la
partícula bacteriofágica mediante un mecanismo llamado “head full” o llenado de
las cabezas del fago.
Ocasionalmente una de las piezas del ADN de la bacteria huésped resulta empacada
al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto, cualquier gen de la bacteria
donadora puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferirá tanto
DNA como pueda caber en una sola cápside.
Cuando la célula receptora se infecta con un fago que contiene ADN de una dadora,
el ADN de la dadora puede entrar a la receptora. Ya dentro de la célula receptora
puede ocurrir el evento de la recombinación generalizada, en el cual se substituye el
ADN de la célula dadora por el de la receptora
Describa la transducción especializada
La transducción especializada es el tipo de
transducción en la cual solo ciertos genes del dador pueden ser transferidos al
receptor. Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes, pero un fago
individual solamente puede transferir unos pocos. La transducción especializada
está mediada por fagos lisogénicos o temperados y los genes que se llegan a
transferir dependerán del lugar donde el profago quede insertado en el cromosoma.
Durante la escisión del profago, un error llega a ocurrir ocasionalmente en el cual un
pedazo pequeño del ADN del hospedero escinde (se separa del cromosoma) junto
con el ADN del fago. Solo puede ser transferido el ADN del hospedero que esté
flanqueando a cada lado del sitio donde el profago se ha insertado.
Después de la replicación y la liberación del fago y a través de la infección de la
célula receptora, puede ocurrir una lisogenización de la receptora dando como
resultado la transferencia estable de los genes de la dadora. La receptora ahora
tendrá dos copias de los genes que le fueron transferidos. También es posible que
se lleve a cabo una recombinación legítima entre los genes de la dadora y de la
receptora
¿Qué son los bacteriofagos?
Los bacteriófagos, también llamados fagos, son virus que infectan exclusivamente
a bacterias, son parásitos intracelulares obligados que se multiplican al interior de
estas, haciendo uso de algunas o todas sus maquinarias biosintéticas. Podemos
encontrar fagos líticos y fagos lisogénicos o temperados.
Al igual que los virus de células eucariontes, los bacteriófagos están constituidos
por una cápside en cuyo interior está contenido su material genético, que puede ser
ADN de entre 5.000 a 500.000 pares de bases, aunque también puede estar
conformado por ARN. El tamaño de los fagos va entre 20 y 200 nm
aproximadamente.
Los fagos pueden ser encontrados en cualquier ambiente y se pueden encontrar en
variadas poblaciones de bacterias, tanto en el suelo, como pozas, charcos e incluso
en la microbiota intestinal de los animales. Uno de los ambientes más poblados por
bacteriófagos es el agua de mar, donde se estima que puede haber en torno a 109
partículas virales por ml, pudiendo estar infectadas por fagos aproximadamente un
70% de las bacterias marinas.
¿Qué son los fagos líticos?
Los fagos líticos son fagos que solo pueden multiplicarse en bacterias y matan a la
célula debido a la lisis al término del ciclo de vida. Los fagos líticos se cuentan
mediante ensayos de formación de placas. Una placa se define como el área clara
que resulta de la lisis de bacterias. A la partícula infecciosa que da origen a la placa
se le llama una unidad formadora de placa (UFP).
Se observa en placas de agar como puntos blancos pequeños.
¿Qué son los fagos lisogénicos?
Los bacteriófagos lisogénicos o temperados son aquellos que bien pueden
multiplicarse vía el ciclo lítico o entran en un estado de latencia en la célula. En este
estado latente la mayoría de los genes del fago no se transcriben; el genoma del
fago existe en un estado reprimido. Al ADN del fago en este estado reprimido se le
conoce como profago.
¿Cuál es la diferencia entre lisogenia y pseudolisogenia?
La célula que alberga un profago puede estar en
estado de Lisogenia (material genético del fago inserto en el cromosoma
bacteriano) o Pseudolisogenia (cuando el material genético del fago está inserto en
un plásmido bacteriano). Esto puede ser evidenciado en una placa de Agar EBU
(Evans Blue Urenina), también llamada placa verde. Esta placa contiene un indicador
de pH el cual mantiene el color verde a pH neutro, y azul oscuro a un pH ácido. Las
colonias lisogénicas y no lisogénicas forman colonias claras y de un tamaño mayor,
las colonias pseudolisogénicas tienen muchas células entrando en lisis celular lo
que disminuye el pH de la colonia, haciendo que esta sea de tamaño pequeño y de
un azul oscuro.
¿Qué es el fago p22?
El fago P22 es un bacteriófago lisogénico, que infecta a Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Typhimurium (Salmonella Typhimurium) uniéndose
al antígeno O, que es parte de los lipopolisacáridos de la membrana externa. Este
virus puede generar procesos de transducción generalizada. Cuando se ensambla
el virus, se crea una competencia entre los genes del virus y los genes de Salmonella,
por esto, en ocasiones se empaqueta en la cápside fragmentos del genoma de
Salmonella, pudiendo incorporarse este al de la siguiente célula hospedera. Este
bacteriófago posee una versión lítica conocida como fago H5 o fago P22 H5
Describa el procedimieto para la determinación del título viral de una muestra de fagos
Materiales:
150 ul de cultivo líquido del fago P22 o H5.
10 ml de Caldo LB
1 tubo con 8ml de LB semisólido
1 placa de Agar LB.
2 ml Cultivo de Salmonella Typhimurium Wild-Type OD600: 0,6.
8 tubos eppendorf de 1,5ml.
Procedimiento:
- Colocar 900ul de LB a cada eppendorf.
- Rotular los tubos con las diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
- Al tubo rotulado con 10-1 agregar 100ul de la muestra del fago y homogenizar.
- Al tubo 10-2 agregar 100ul del tubo 10-1 y homogenizar suavemente.
- Continuar sucesivamente hasta la dilución 10-6
- Tomar 1 placa de agar corriente y dividir en 8 espacios rotular cada una con el
nombre de cada dilución, incluir además control del medio LB y el fago directo.
- A un tubo de agar blando adicionar el cultivo de Salmonella y homogenizar.
- Vaciar el tubo con la mezcla dentro de una placa de agar y dejar secar cerca al
mechero.
- Añadir 2 gotas de 10 ul de cada dilución, el fago directo e incubar ON a 37⁰C.
Describa el procedimiento para determinar el estado del profago
Materiales:
1 Cultivo con Placas de Lisis del Fago P22 o del Fago H5.
Puntas de Micropipeta.
1 Placa Agar Evans Blue.
Procedimiento:
- Picar con la punta de micropipeta el centro de una placa de lisis de P22.
- Sembrar en zigzag en una placa de agar Evans Blue con la punta de pipeta.
- Repetir los pasos anteriores, pero en este caso con el Fago H5.
- Incubar O.N. a 37°C
Describa el procedimiento para la transducción de plásmidos
Materiales:
-5 ml de caldo LB:Amp.
-250 ul del lisado del fago P22/pkkGFP.
-10 ml de Salmonella Typhimurium Wild-Type OD600: 0,6.
-2 Placas de Agar LB:Amp.
Procedimiento:
- A un tubo falcon con 5 ml de caldo corriente agregar 250 ul del fago P22pkkGFP y
10 ml de Salmonella Typhimurium Wild-Type, homogenizar suavemente.
- Incubar 2 horas a 37°C
- Centrifugar a 6.000 rpm por 7 minutos y resuspender en 100 ul de caldo LB.
- Sembrar en zigzag en una placa de agar LB:Amp y en otra placa en césped el
resto de los 100ul.
- Incubar O.N. a 37°C.
Describa el procedimiento para la movilización de plásmidos por conjugación
-5 ml de caldo LB.
-15 ml del cultivo de Salmonella Enteritidis ROD21::Kn (donante) OD600: 0,6.
-15 ml del cultivo de Salmonella Enteritidis ΔROD21::Cm (receptora) OD600: 0,6.
-2 Placas de LB Agar Cm:Kn
Procedimiento:
- A un tubo falcon con 5 ml de caldo corriente agregar 15 ml del cultivo Salmonella
Enteritidis ROD21::Kn y 15 ml del cultivo de Salmonella Enteritidis ΔROD21::Cm.
- Incubar 1 hora a 37°C.
- Centrifugar a 6.000 rpm por 7 minutos y resuspender en 100 ul de caldo LB.
- Dividir una placa de agar corriente Cm:Kn en tres zonas y sembrar en zigzag la
cepa de Salmonella Enteritidis ROD21::Kn, la cepa de Salmonella Enteritidis
ΔROD21::Cm y la mezcla de las dos que se estaba incubando.
- En otra placa de agar corriente Cm:Kn sembrar 100ul de la mezcla en césped.
- Incubar O.N. a 37°C.
