Laboratorio 2

Question 1

¿Qué es la fisiotaxonomía bacteriana?

Answer 1

La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través
de las alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han
permitido establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su
clasificación en diferentes géneros y especies.

Question 2

Cómo se clasifican las técnicas de identificación bacteriana

Answer 2

Por utilización de fuentes de carbono:
- Glucosa
- Lactosa
- Galactosa
- Manitol
- Sorbitol
- Citrato

Por formación de productos intermediarios o finales del metabolismo
- H2S
- CO2
- Indol
- Acetilmetilcarbinol

Por Presencia de enzimas

-Ureasa
-Oxidasa
-Catalasa
-Coagulasa

Por sensibilidad a compuestos químicos y antibióticos.

• Bacitracina
• Novobiosina
• Optoquin

Question 3

¿Cuáles técnicas se usan fundamentalmente para bacterias Gram positivas?

Answer 3

Test de la catalasa
Test de la coagulasa
Test de aglutinación por partículas de látex.

Question 4

¿Cuáles técnicas se usan fundamentalmente para bacterias Gram negativas?

Answer 4

Batería bioquímica convencional
API 10S
Agares diferenciales

Question 5

Describa el test de la coagulasa

Answer 5

Buscar presencia de enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus. La
enzima es un activador de fibrinógeno a fibrina. Además, la pared de la bacteria
posee receptor de fibrinógeno que permite la formación de puentes entre bacteria y
bacteria. Este test es se utiliza para diferenciar Staphylococcus aureus de otros
Staphylococcus coagulasa negativo.
Se realiza en tubo con plasma de conejo o en lámina como test de aglutinación.

Se debe colocar una gota del reactivo
látex sobre un círculo de la tarjeta, a continuación, la colonia sospechosa se
emulsiona sobre la gota y se agita durante unos segundos y si hay formación de
grumos visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo
que está incluido en el kit.

Precauciones: Tomar la muestra con puntas de plástico o con mondadientes.

Question 6

Describa el test de la catalasa

Answer 6

Buscar presencia de la enzima catalasa, que descompone H2O2 en H2O y O2. La
enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo, la
excepción es el género Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. Permite
diferenciar Staphylococcus de Streptococcus.

Test positivo: aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos).
Precauciones: No tocar el agar sangre al tomar la colonia, ni usar asas
microbiológicas, ya que dan falsos positivos.

Question 7

Describa la batería convencional

Answer 7

Una batería bioquímica es un conjunto de medios de cultivos diferenciales y
selectivos, lo cuales nos permitirán evidenciar diferentes reacciones bioquímicas y
metabólicas. Estos medios, al ser inoculados con la muestra problema, presentan
diferentes resultados que, en conjunto, nos permitirán llegar a la identificación de
un género o especie bacteriana.

Question 8

Describa la batería API 10S

Answer 8

El API 10S es un sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y
otros bacilos Gram negativos, que utiliza 11 pruebas bioquímicas con sustratos
deshidratados más una prueba con la muestra utilizada crecida en agar corriente.

Reacciones del API 10S e interpretación de resultados.

TEST REACCIONES - POSITIVO * NEGATIVO

ONPG:Presencia de la β-galactosidasa
Amarillo * Incoloro

GLU: Fermentación / Oxidación glucosa Amarillo Amarillo grisáceo Azul * Azul verdoso

ARA: Fermentación / Oxidación arabinosa
Amarillo Azul * Azul verdoso

LDC: Presencia de lisina descarboxilasa
Naranja * Amarillo

ODC: Presencia de ornitina descarboxilasa
Rojo * Naranja Amarillo

CIT: Utilización del citrato
Azul verdoso / Azul * Verde pálido / Amarillo

H2S: Producción de H2S Depósito /Línea negra Incoloro * Gris

URE: Presencia de la enzima ureasa
Rojo / Naranja * Amarillo

TDA Presencia de triptófano desaminasa
Marrón oscuro * Cualquier otro color

IND: Producción de indol
Rosado / Rojo * Cualquier otro color

NO2: Producción de nitritos
Rojo Amarillo * Azul

OX: Presencia de citocromo oxidasa
Púrpura/Café * Amarillo

Algunas de estas pruebas necesitan reactivos para su lectura:
TDA: agregue una gota del reactivo TDA en el bolsillo TDA.
IND: Agregue una gota del reactivo de James en el bolsillo IND
NO2: Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el bolsillo GLU.
OX: Colocar directamente la muestra sospechosa en el extremo de una varilla que
contiene un reactivo oxidable

Question 9

¿Qué es y que indica el caldo glucosado en campana?

Answer 9

Es un medio rico en nutrientes, y no contiene
inhibidores del crecimiento bacteriano. El extracto de carne y la peptona, son la
fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la glucosa es el hidrato de carbono. Por
la fermentación de la glucosa, se produce ácido y gas, y éste último se demuestra
al usar las campanas Durham.

AG - Presencia de gas atrapado en la campana, indica acidez del medio de cultivo por
fermentación de glucosa, hasta la formación de gas. Se lee Ácido-Gas.

A - No hay presencia de gas en la campana. *En este caso se deben agregar 3 gotas
del indicador Azul de Bromotimol, si se produce un color amarillo se lee como Ácido.

• No hay presencia de gas en la campana. *En este caso se deben agregar 3 gotas
  del indicador Azul de Bromotimol, si se produce un color verde o azulado se lee
  como Negativo.

Question 10

¿Qué es y que indica el agar manitol con rojo fenol?

Answer 10

Agar compuesto por manitol el cual es el carbohidrato
de prueba y su fermentación se manifiesta por un cambio de color del indicador rojo
de fenol, que vira de rojo a amarillo.

+ El medio se toma color amarillo, hay fermentación del medio nutritivo y producción
de acidez.
- Color rojo indica alcalinidad del medio

Question 11

¿Qué es y que indica el caldo sorbitol con rojo fenol?

Answer 11

La peptona de caseína proporciona al medio los
nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos. El sorbitol es el
carbohidrato de prueba y su fermentación se manifiesta por un cambio de color del
indicador rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo.
+ El medio se toma color amarillo, hay fermentación del medio nutritivo y producción
de acidez.
- Color fucsia oscuro/rosado indica alcalinidad del medio

Question 12

¿Qué es y que indica el agar citrato de Simmons?

Answer 12

Esta prueba, nos permitirá determinar si el
microorganismo es capaz de utilizar el Citrato como única fuente de carbono.
Contiene el indicador Azul de Bromotimol.
+ Color azul por utilización del Citrato como única fuente de Carbono, lo que produce
una alcalinización del medio, por liberación de Amonio.
- Color verde ya que no hay crecimiento ni acidificación, por no ser capaz de utilizar el
Citrato como única fuente de Carbono

Question 13

¿Qué es y que indica el caldo urea?

Answer 13

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes
para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el rojo fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea
por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos
productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo.
+ Color fucsia, ya que la bacteria posee Ureasa, metaboliza el sustrato y esto provoca
alcalinidad del medio al producir amoníaco.
- No hay cambio en el medio.

Question 14

¿Qué es y que indica el medio de Voges-Proskauer?

Answer 14

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de
un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido
mixta o con producción de un producto final neutro: Acetilmetilcarbinol. Este tubo
se debe dividir en 2 volúmenes iguales en dos tubos distintos.

Tubo 1: Producción de Acetilmetilcarbinol (Reacción de Voges-Proskauer)

*Agregar 10 gotas de Alfa Naftol y 4 gotas de KOH al 40%. Agite y deje por 15 min.

La aparición de un color rosado constituye una reacción positiva indicadora de la
presencia de acetoína, producto de la fermentación de la glucosa.

+ Color rosado oscuro después de los 15 minutos, significa que hay presencia de
acetilmetilcarbinol.
- Color café o anaranjado indica que no hay producción de acetilmetilcarnibol.

Tubo 2: Producción de acidez bajo pH 4,5 (Reacción Rojo de Metilo)
*Agregar una gota del indicador Rojo de Metilo.

Una coloración roja, indicadora de
la presencia de ácidos provenientes de la fermentación de la glucosa, constituye un
resultado positivo, una coloración amarilla constituye una reacción negativa.

+ Color rojo indica que la bacteria ha acidificado el medio hasta pH 4,5 o más bajo.
- Color café o naranja indica que la bacteria no fue capaz de acidificar el medio.

Question 15

¿Qué es y que indica el caldo corriente?

Answer 15

Este caldo utilizado para el crecimiento de bacterias en general,
contiene tripteína que aporta grandes cantidades de triptofano, el sustrato de la
enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.
*Se agregan 10 gotas del reactivo de Kovacs.

+ Anillo color fucsia en la parte superior del líquido. Indica producción de Indol, a partir
de la metabolización del triptofano.
- Anillo color café o amarillo, indica ausencia de Indol.

Question 16

¿Qué es y que indica el agar corriente?

Answer 16

En este agar podemos evidenciar las capacidades propias de la
bacteria para producir pigmentos en sus colonias.
+ Colonias bacterianas presentan alguna pigmentación.
- Colonias bacterianas no presentan pigmentación

Question 17

¿Qué es y que indica el agar TSI?

Answer 17

(Triple Sugar Iron): Contiene 3 azúcares: Lactosa, Sacarosa y Glucosa y
como indicador de pH Rojo Fenol. Después de 24 horas de incubación a 37°C, si la
superficie (tendido) permanece rojo y la profundidad vira a amarillo (K/A), se ha
producido la fermentación de la glucosa (etapa anaeróbica de la glucólisis). Si tanto
la superficie como la profundidad viran al amarillo (A/A), se han fermentado los 3
azúcares. Si la superficie y la profundidad viran al rojo (K/K) no se produjo
fermentación de ningún azúcar.

K/A Color rojo en superficie y color amarillo en profundidad. Solo hay fermentación de
Glucosa.
A/A Color amarillo en superficie y profundidad. Hay fermentación de los tres azúcares
presentes.
K/K Color rojo en superficie y en profundidad. No se ha fermentado ningún azúcar.

Question 18

¿Qué es y para que sirve el agar LIA?

Answer 18

(Lysine Iron Agar): Si la bacteria no actúa sobre la Lisina, se produce la
fermentación de la glucosa que contiene el medio, virando el indicador Púrpura de
Bromocresol al color amarillo en el fondo del tubo y el tendido se mantiene del
mismo color (K/A). Si la bacteria descarboxila la Lisina, (reacción se produce en
medio ácido, posterior a la fermentación de la glucosa), se libera Cadaverina, que al
ser un compuesto alcalino neutraliza la acidez y hace que el indicador vire a un color
púrpura intenso (K/K).

K/K Color púrpura intenso en la superficie y en la profundidad.
K/A Color púrpura en la superficie, y amarillo en la profundidad.

Question 19

¿Qué es y para que sirve el agar MIO?

Answer 19

(Motilidad Indol Ornitina): Medio de cultivo semisólido, altamente
nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. La
dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la
detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el
indicador de pH, que en medio alcalino es púrpura y en medio ácido es amarillo.

*Motilidad
La motilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que
difunde más allá de la línea de inoculación.

+ Alrededor del lugar de la picadura hay crecimiento bacteriano, se observa por turbidez
de todo el medio.
- Crecimiento bacteriano se limita a la zona de la picadura, hay zonas cristalinas.

*Ornitina
La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido
a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y
originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La
presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima
ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación,
se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.

+ Color púrpura del medio, indica alcalinización del medio.
- Color amarillo/anaranjado predominante indica acidez del medio

Question 20

¿En dónde se ve la producción de H2S?

Answer 20

La aparición de color negro en la siembra en profundidad en el medio TSI o LIA
demuestra la presencia de enzimas proteolíticas. El color negro se debe a la
presencia de H2S que se produce en la degradación del Tiosulfato de Sodio que
contiene el medio. Al combinarse el Sulfuro de hidrógeno con el indicador Citrato férrico amoniacal (LIA) o Sulfato Ferroso (TSI) que contiene el medio, se forma en
ausencia de oxígeno Sulfuro de Hierro, de color negro.

+ Color negro en el fondo del tubo.
- Sin presencia de color negro en el tubo.

Question 21

¿Qué es y que indica el agar Salmonella-Shigella?

Answer 21

El agar Salmonella-Shigella es un medio de cultivo
selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por las sales biliares y el verde
brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas. Es diferencial debido
a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del
tiosulfato de sodio. Es un medio utilizado principalmente para diferenciar entre los
géneros Salmonella y Shigella, sin embargo, se puede utilizar para otras
enterobacterias.
Los microorganismos fermentadores de lactosa acidifican el medio haciendo virar
a rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo
rojizo. Los microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio
de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se
evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de
hierro.

Resultados del crecimiento bacteriano en agar Salmonella-Shigella.

Microorganismo —> Colonias

Salmonella Typhimurium —> Transparentes con centro negro

Shigella flexneri —> Transparentes

Escherichia coli —>Rosadas a rojas

Pseudomonas aeruginosa —>Transparentes tornando a naranjas, mucosas

Proteus mirabilis —> Transparentes, grandes y con centro negro

Klebsiella pneumoniae —> Rosadas, cremosas y mucosas

Question 22

¿Qué es y que indica el agar Hektoen entérico?

Answer 22

El agar Hektoen Entérico contiene sales que biliares hacen
que el medio sea selectivo, inhibiendo los microorganismos Gram positivos.
Además, contiene lactosa, sacarosa y salicina para una óptima diferenciación según
el color de las colonias y del medio adyacente a éstas.
Salmonella y Shigella no fermentan estos compuestos de carbono y, por tanto, no
ocasionan un cambio de color en el sistema indicador del pH, en tanto que los
microorganismos como Escherichia coli, por ejemplo, que fermentan uno o más de
tales compuestos hasta convertirlos en ácidos, causan un cambio de color a
amarillo o anaranjado.
El citrato férrico de amonio y el tiosulfato sódico del medio permiten detectar la
producción de sulfuro de hidrógeno por la Salmonella. El sistema indicador del pH
consta de fucsina ácida y azul de bromotimol.

Resultados del crecimiento bacteriano en agar Hektoen entérico.

Microorganismo —> Colonias

Salmonella Typhimurium —>Verde-azuladas, con centro muy negro

Shigella flexneri —> Verdes, elevadas, húmedas

Escherichia coli —> Naranja brillante rodeadas por un precipitado biliar

Pseudomonas aeruginosa —> Verde azuladas claras, elevadas

Proteus mirabilis —> Verde-azuladas, con o sin centro negro

Klebsiella pneumoniae —> Naranja claro rodeadas por un precipitado biliar

Question 23

¿Qué es y que indica el agar XLD?

Answer 23

El Agar XLD es un medio selectivo y de diferenciación. Contiene extracto
de levadura como fuente de nutrientes y vitaminas. Utiliza el desoxicolato de sodio
como agente selectivo para inhibir a los microorganismos Gram positivos. La xilosa
se incorpora en el medio dado que la fermentan prácticamente todos los entéricos,
excepto Shigella. La lisina se incluye para permitir la diferenciación del grupo
Salmonella de los organismos no patógenos, cuando la Salmonella agota el
suministro de xilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo que
genera un cambio a un pH alcalino que imita la reacción de Shigella.
Además, este posee lactosa y sacarosa para producir ácido en exceso cuando hay
presencia de coliformes. Para aumentar la capacidad de diferenciación de la
fórmula, se incluye un sistema indicador de H2S, formado por tiosulfato sódico y
citrato férrico amónico, para la visualización del ácido sulfhídrico producido, lo que
origina la formación de colonias con centros de color negro.

Resultados del crecimiento bacteriano en agar XLD.

Microorganismo —>Colonias

Salmonella Typhimurium —> Roja y transparente con centro negro

Shigella flexneri —> Roja y transparente
Escherichia coli —> Amarilla y opaca, precipitación amarilla alrededor de la colonia

Pseudomonas aeruginosa —> Colonias transparentes y mucosas.

Proteus mirabilis —> Amarilla, transparente con bordes claros y centro negro.

Klebsiella pneumoniae —-> Grande, amarillo claro, mucoide u opaca

Question 24

¿Cómo se realiza la siembra de inóculo en una batería bioquímica convencional?

Answer 24

En medios sólidos (Agar corriente, agar citrato y agar manitol) Se siembra con asa en zigzag por la superficie.

En medios semisólidos (Agar LIA y agar TSI) pinchar el fondo con asa y sembrar en zigzag por la superficie.
En el medio semisólido agar MIO sólo se pincha hasta el medio del agar con el asa.

Y en medios líquidos (Caldo corriente, sorbitol, glucosaso, urea y Voges-Proskauer) se agita el inóculo con el asa dentro del medio.

Question 25

¿Cómo se realiza la siembra de la bateria comercial API 10S?

Answer 25

1. Se prepara una suspensión bacteriana en 5 ml de suero fisiológico.
2. Se llenan los microtubos con la suspensión bacteriana hasta llenar el bolsillo de
   todas las pruebas y, además, la cúpula del test CIT.
3. Se llenan las cúpulas de los test LDC, ODC, H2S y URE con aceite mineral, para crear
   una atmósfera de anaerobiosis.
4. Se deposita el test en una cámara con celdillas las cuales deberá llenar con agua
   para evitar la deshidratación.
5. Se incuba el test por 18 a 28 horas a 37°C.