Labo 8 : PCR et son utilisation pour l'identification d'individus Flashcards
Les lettres PCR tiennent pour ?
La PCR permet de choisir un segment d’ADN particulier dans un génome et ? cette séquence cible de manière ? afin d’en obtenir des millions de copies.
Technique d’amplification in vitro mise au point par ? en 1985 (prix Nobel en 1993)
Facteur-clé de son succès fulgurant = ?
polymerase chain reaction
d’amplifier
exponentielle
K. Mullis
utilisation de l’ADN polymerase Taq (enzyme résistante à la chaleur) qui permet de générer des fragments d’ADN ne dépassant pas généralement 4 kb.
Ensemble d’enzymes qui participe à la réplication de l’ADN, c’est-à-dire à la copie des chromosomes = ? Ainsi, lorsqu’un brin d’ADN se forme, elle intervient pour produire deux molécules identiques à la molécule de départ. Elle est responsable de la synthèse des nouvelles molécules d’ADN. Toutefois, elle ne peut qu’ajouter des nucléotides (molécules qui constituent la base de l’ADN) en complémentarité de ceux déjà existants, elle n’est pas capable de créer elle-même un brin d’ADN sans point de départ.
ADN polymerase
En biologie moléculaire, courte séquence d’ARN ou d’ADN, complémentaire au début d’une matrice, servant de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette dernière matrice par une ADN polymérase = ?
amorce
Petit segment d’ADN simple brin ou d’ARN, comptant quelques dizaines de nucléotides = ?
Sert d’amorce pour amplifier un fragment d’ADN par la réaction de PCR. Pour cela, il doit être complémentaire à une des extrémités du fragment d’ADN à amplifier.
oligonucléotide
Processus de jonction de deux brins complémentaires d’ADN = ?
hybridation
En biologie moléculaire, ? des bases est la liaison hydrogène spécifique entre les purines et les pyrimidines dans les acides nucléiques double brin.
l’appariement
Version d’un gène occupant une place précise sur un chromosome, qui peut varier d’un individu à l’autre.
OU
Qualifie les gènes situés au même endroit sur les chromosomes d’une même paire.
allèle
? est une partie donnée de l’information génétique (composition génétique) d’un individu. C’est donc la composition allélique de tous les gènes de cet individu. La définition de génotype sert également lorsque l’on considère la composition allélique d’un individu pour un nombre restreint de gènes d’intérêt. Par exemple, s’il existe deux formes du gène X : l’allèle Xa et l’allèle Xb, alors le génotype d’un individu pour le gène X peut être soit homozygote (Xa/Xa ou Xb/Xb), soit hétérozygote (Xa/Xb). L’être humain possède deux copies de chaque gène, donc potentiellement, 2 allèles différents au maximum.
le génotype
Ensemble des caractères observables d’un individu. Il dépend de l’expression des gènes (génotype) et de l’environnement = ?
le phénotype
Propriétés importantes de l’ADN (3)
Tout ceci grâce à ?
- Dénaturation/renaturation
- Hybridation/appariement
- Élongation de l’amorce par une ADN polymérase (direction 5’ vers 3’)
la complémentarité des bases
La réaction PCR
Réactifs nécessaires : (4)
Étapes d’un cycle : (3)
Combien de cycles en tout, pourquoi? et durée totale ?
À la fin du dernier cycle qu’est-ce qu’on fait?
- Après cycle 20, on a 1 million de copies
- Après cycle 25, on a 33 millions de copies de notre région d’intérêt seulement.
- ADN chromosomique avec segment spécifique d’intérêt qu’on souhaite copier, des nucléotides, Taq polymerase, oligonucléotides de synthèse d’environ 20 nuc de long forward et reverse
1 - 95 degrés celsius pour dénaturation et séparation des brins pendant 30-60 secondes
2- 60 degrés pour fixation couple d’amorces (les amorces créent liaisons hydrogène et se lient avec un brin chaque (de 5’ à 3’)) pendant 30-60 secondes
3- 72 degrés pour que la Taq polymerase fasse son travail d’appariement à température optimale pendant 30-60 secondes (durée dépend de longueur séquence cible : 1 kb/min)
- 20 à 30 cycles car au-delà de 20-25 cycles l’enzyme est de moins en moins efficace à force de subir des 95 degrés et réaction atteint plateau
Ça dure plusieurs heures - On fait une étape d’élongation additionnelle pour s’assurer que la synthèse de tous les brins est complète.
ADN polymerase Taq
Isolée à partir de la bactérie thermophile ?
Température optimale = ?
Résiste aux températures élevées, max = ?
Elle catalyse la polymérisation d’une molécule d’ADN en ajoutant des désoxyribonucléotides à partir de l’extrémité ?
Thermus aquaticus
72 degrés celsius
95 degrés celsius (pour quelques minutes)
3’
Brin Watson = ?
Brin Crick = ?
5’ - 3’ donc amorce forward (amorce L)
3’ - 5’ donc amorce reverse (amorce R)
Lors d’une réaction PCR, l’équation pour prédire le nombre total de copies de la séquence cible ?
Y = nbr final de copies, X = nombre initial de copies, n = nombre de cycles
Y = x 2 à la n
Quel appareil est utilisé pour produire les changements de température à chaque cycle lors de la réaction PCR ?
thermocycleur
