Clonage des gènes Flashcards
Ensemble des gènes qui concertent le développement d’un attribut observé chez un système biologique = ?
Attribut/trait observable chez une système biologique = ?
Génotype
Phénotype
Différentes approches pour l’exploitation des phénotypes
Ex : le taxol, contenu dans l’écorce de 2 à 4 arbres centenaires est un médicament efficace contre le cancer de l’ovaire et du poumon.
Comment en récupérer?
- Synthèses chimiques (pas efficace/écologique)
- Manipulations génétiques des cultures cellulaires de l’arbre
- Expression des gènes dans un autre système biologique plus malléable
Implique l’expression d’un gène chez un organisme qui le possède naturellement (manipulation génétique qui a pour but d’induire une forte transcription du gène cible qui résulte à une haute quantité de ARNm qui, en se traduisant, résulte à une haute production de la protéine traduite) = ?
Expression d’un gène chez un organisme qui ne le possède pas naturellement = ?
expression homologue (gène endogène)
expression hétérologue (gène exogène)
Avantages de manipuler la nature pour générer et/ou amplifier des biomolécules d’intérêt : (production des phénotypes d’intérêt en exploitant des systèmes biologiques) (3)
- Moins coûteuse
- Plus écologique (les systèmes biologiques peuvent efficacement utiliser des éléments nutritifs variés comme les déchets, en les convertissant en des phénotypes désirés
- Plus saines (malgré le fait que les phénotypes sont générés par manipulation génétique, ils demeurent plus seins que les contreparties synthétisés/fabriqués par l’humain)
Toute application technologique utilisant des systèmes biologiques pour fabriquer ou modifier des phénotypes à usage spécifique = ?
biotechnologie
Production délibérée d’une copie génétiquement identique d’un gène, d’une cellule, d’une plante ou d’un animal = ?
clonage
(moléculaire/génétique)
(reproductif)
Étapes générales du clonage moléculaire/génétique
- Gène à cloner ou fragment d’ADN = ?
- Véhicule du gène à cloner (ex: plasmide) = ?
- Construction génétique portant un gène cloné = ?
- Transformation/transfection = ?
- Cultivation
- ?
Insert
Vecteur
ADN recombinant
Transport dans un hôte
Extraction de l’ADN recombinant en million de copies
Applications du clonage moléculaire (3)
- Pour étudier fonctions des gènes
- Pour reproduire phénotype intéressant codé par ces gènes
- Pour générer même un nouveau phénotype
Il existe plusieurs méthodes de clonage moléculaire…
1. Clonage conventionnel = ?
Ce qui vient ligaturer ?
Avantages ? (3)
Désavantages ? (4)
Clonage par des enzymes de restriction
Digestion par enzymes de restriction (sites de coupure reconnus par enzymes), purification par colonne (chromatographie) du vecteur, ajout de l’insert avec ligase pour la ligature, ça nous donne ADN recombinant
Méthode bien étudiée, très connue et accessible + abordable + possibilité d’ajout de plusieurs sites de restriction sur chaque extrémité pour augmenter les options et les stratégies de clonage
Choix des enzymes de restriction sont limités par la nécessité d’absence de leur site de reconnaissance à l’intérieur des inserts et vecteurs. + clonage directionnel ne peut pas se faire avec les enzymes de restriction qui génèrent des bouts francs (il faut bouts collants) + pas efficace pour cloner plus de 2 fragments d’ADN + laisse des cicatrices ou les sites de restriction après clonage directionnel
Les 3 types de coupure par enzymes de restriction
- Bout protubérant/extrémité cohésive 3’
- Bout protubérant/extrémité cohésive 5’
- Bout franc/extrémité franche
- Clonage par la recombinaison Gateway = ?
Mots-clés : (4)
Avantage ?
Désavantages ?
Dépend de la recombinaison homologue (insert ou notre produit PCR porte des bouts identiques à ceux sur le vecteur donneur, puis l’enzyme BP clonase va faire la recombinaison pour créer clone d’entrée et sous-produit alors que l’insert natif est remplacé par insert d’intérêt, puis si on veut faire sauter l’insert de notre plasmide à un autre on utilise LR clonase
ici on se retrouve avec plasmide initial et nouveau plasmide, mais le plasmide initial est un sous-produit TOXIQUE donc bactéries qui l’auront vont mourir
On finit avec 4 types de plasmides mais seulement 2 vont pouvoir se multiplier dans une bactérie.
Donc, pour finir avec notre seul plasmide d’intérêt, on va mettre un antibiotique auquel il est résistant pour que l’autre plasmide meurt
Produit PCR
BP clonase (recombinase)
LR clonase (recombinase)
Sous produit toxique
Simple et efficace
Plasmides et enzymes Gateway sont dispendieux
On ne peut pas revenir au clonage conventionnel après, à moins d’avoir vraiment planifié
- Clonage TOPO (clonage TA) = ?
Mots-clés : (4)
Avantage ?
Désavantages ?
Insert amplifié par polymérase Taq avec Adénine 3’ ce qui génère naturellement extrémités collantes, vecteur TOPO a thymine extrémités 3’
On mélange les 2 fragments et on incube 5 minutes à température pièce
Taq polymerase
Adenine 3’ (insert)
Thymine 3’ (vecteur TOPO)
5 minutes température pièce
Simple et rapide
Pas directionnel
Utilisation polymerase Taq a un taux d’erreur de 1 pour chaque 3500 bases
Extrémité 3’-A n’est pas stable (quelques semaines se dégrade) ce qui diminue efficacité de cette méthode
Vecteur TOPO se vend juste par la compagnie
- Clonage Gibson (Gibson Assembly) = ?
Très bien et récent!
Il vend sa trousse énormément, la plus utilisée en biologie synthétique!
Mots-clés :
Assemblage… produit PCR portant des extrémités homologues aux fragments voisins (2 inserts) et vecteur linéarisé qui est un produit PCR ou de digestion par des enzymes de restriction avec des bouts connus. On mélange les 3 fragments et on les incube de 15 à 60 minutes à 50 degrés.
La trousse Gibson comprend 5’-exonucléase, polymérase et ligase
Produit PCR avec extrémités homologues aux fragments voisins
Mélanger et incuber 3 segments 15-60 min à 50 degrés
Trousse Gibson avec 5’-exonucléase (gruge bas droite et haut gauche pour rendre bouts protubérants et enlever un brin mais est lent), polymérase (reremplir nucléotides trop dégradés) et ligase (cémenter pour créer liens covalents forts)
Fragments bouts francs
*Directionnel
- Clonage Gibson (Gibson Ultra Assembly) =
Nuance avec une modification : 3’-exonucléase sinon le reste est pareil que le précédent
Il est plus doux que le 5’-exonucléase, bon pour les plus petits fragments
- Clonage par les enzymes de restriction Type IIS (Golden Gate) = ?
Mots-clés :
Produit PCR (2 inserts) portant des extrémités homologues aux fragments voisins et sites de reconnaissance d’un endonucléase Type IIS. On mélange avec vecteur linéarisé par une digestion avec une enzyme de restriction Type IIS. On met l’endonucléase Type IIS (qui va dégrader de façon limitée donc de façon spécifique (nbr fixe de nucléotides) région adjacente (3’) et pas site de reconnaissance (5’) pour faire un bout collant) et ligase (cémenter parce que liens hydrogène faibles). (aucune trace site de reconnaissance par la suite)
Endonucléase Type IIS
Ligase
Assemblage de plusieurs fragments Pas de cicatrice Pas de trace site de reconnaissance Rapide et une seule étape Meilleur pour les petits fragments, IDÉAL
