Labo 7 : Isolement de plasmides et digestion avec enzymes de restriction Flashcards
Un ? est une molécule d’ADN distincte de ?, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de la cellule.
plasmide
l’ADN chromosomique
Les plasmides pBR322 et pB322A sont contenus dans 2 souches de la bactérie ? et lui confèrent une résistance à ?.
Le plasmide pBR322 comprend :
Le plasmide pBR322A comprend :
E. coli (chromosome avec 4,6 millions de pb + 1 à 100 copies de plasmide de 3000 à 10 000 pb par bactérie)
l’ampiciline
un site de restriction EcoRI et un BamHI
2 sites de restriction EcoRI (fragment) et un BamHI
La dénaturation des phospholipides et des protéines des membranes cellulaires est assurée par ?, tandis que ? provoque l’augmentation du pH de la solution, ce qui dénature l’ADN chromosomique et plasmidique.
le sodium dodécyl sulfate (SDS)
le NaOH (base forte)
Plasmide recombiné qui, grâce à sa réplication autonome, permet de cloner des gènes = ?
vecteur de clonage
Molécule d’ADN créée en laboratoire composée de séquences nucléotidiques provenant de plusieurs sources créant ainsi des séquences qui n’existent pas dans les organismes vivants = ?
ADN recombinant
Représentation graphique de la localisation des sites de restriction sur une molécule d’ADN = ? (schéma représentant les sites des séquences reconnues par des enzymes de restriction)
Sert à identifier les fragments d’ADN ou à mettre en évidence les ?
carte de restriction (construite en digérant l’ADN avec plusieurs enzymes de restriction (digestions simples et multiples) et en analysant les fragments résultants par électrophorèse sur gel)
polymorphismes
Les ? sont des endonucléases reconnaissant une séquence spécifique, généralement de 4 à 8 nucléotides, qui présentent un motif de ?.
La ? de celles-ci indiquent leur provenance.
enzymes de restriction
palindrome
nomenclature
Le ? est une séquence d’ADN pouvant se lire de la même façon dans les 2 sens par rapport à un point central, soit sur le même brin, soit sur les 2 brins.
palindrome
Polarité de l’ADN…
Chaque brin possède une extrémité ? et une extrémité ?.
Par convention, on lit toujours une séquence de l’extrémité ? vers ?
5’-phosphate
3’-OH
5 vers 3
Enzyme qui catalyse la formation du lien phosphodiester = ?
ligase
Les extrémités ? s’emboîtent de façon palindromique
Les extrémités ? se collent de façon égale
cohésives (extrémité 3’ ou extrémité 5’ protubérante)
franches
Parmi les nucléotides de l’ADN, lesquels sont complémentaires ?
A et T
G et C
Étapes d'extraction des plasmides 1 - ? 2- ? 3 - ? 4 - ?
1- Centrifugation pour récolter bactéries
2- Lyse des bactéries (lyse alcaline avec SDS et NaOH)
3- Précipitation des protéines et ADN chromosomique et renaturation des plasmides
4 - Précipitation des plasmides
L’ADN peut se ? et se ?.
L’ADN natif double brin devient de l’ADN simple brin après dénaturation avec NaOH ou chaleur. Puis, il est renaturé avec baisse de pH ou refroidissement lent (ajout acétate de potassium et ponts hydrogènes vont se reformer).
dénaturer et renaturer
L’ADN est chargé ? à pH plus grand ou égal à 7.
négativement (groupements phosphate perdent leur H)
Procédé permettant la séparation de molécules chargées sur la base de leur mouvement dans un champ électrique = ?
électrophorèse
? est un polysaccharide linéaire (composé naturel) dont l’unité de répétition est un disaccharide : D-galactose et 3,6-anhydro-L-galactopyranose.
Solubilisation = ?
Gélification = ?
Afin de séparer les fragments des plasmides, on procède à un électrophorèse ?
l’agarose
environ 100 degrés
environ 40 degrés
sur gel d’agarose
Afin de visualiser les fragments d’ADN sur gel, il y a 2 produits…
1- Coloration au ? qui est un agent ? et ?
2- Alternative moins dangereuse au premier… qui est aussi moins ?
1- bromure d’éthidium
intercalant et vraiment cancérigène
2- Redsafe
sensible
Vitesse de migration des molécules d’ADN dans un gel d’agarose dépend de plusieurs facteurs… (5)
- % d’agarose
- Force du courant électrique
- Force ionique du tampon d’électrophorèse
- Conformation ADN (linéaire ou circulaire)
- Taille de la molécule
La concentration d’agarose influence ? du gel.
la porosité (petite concentration fait que la taille des molécules séparées est plus grande donc pores plus grands, grande concentration fait que les pores sont plus petits)
Détermination de la taille de fragments d’ADN sur gel…
Pour des fragments linéaires, la distance de migration (x) est ? au log de la taille (poids moléculaire) des fragments.
Pour une longueur donnée, la quantité d’ADN est ? à l’intensité de la bande.
inversement proportionnelle
proportionnelle
Le ? comprend un mélange de fragments d’ADN dont les longueurs sont connues.
standard de poids moléculaire
(Pour déterminer la taille d’un plasmide superenroulé, il faut utiliser des plasmides superenroulés de tailles connues comme standards)
Conformations d’ADN que peuvent prendre les plasmides : (3)
ADN relâché
ADN linéaire
ADN circulaire superenroulé
L’ADN et l’ARN sont des polymères de ? réunis par des liaisons ?.
Sucre ADN = ? Sucre ARN = ?
La ? des brins se définit selon la position du phosphate sur le sucre. Par convention, on lit toujours de ? vers ?.
Dans la molécule d’ADN double brin, les 2 brins sont ? et ?.
Les bases s’associent par ?
La complémentarité des bases est à la base des propriétés de ?/? de l’ADN, de ? et de la ? de l’ADN.
nucléotides phosphodiesters désoxyribose, ribose polarité 5'P vers le 3'OH (gauche à droite) antiparallèles et complémentaires liaisons hydrogènes (A=T, G triple liaison C) dénaturation/renaturation l'hybridation polymérisation
Les bases puriques = ? et ?
Les bases pyrimidines = ?, ? et ?
Bases de l’ADN =
Bases de l’ARN =
Adénine et Guanine
Cytosine, thymine et uracil
ATGC
AUGC
Liaisons hydrogènes entre les bases…
Liaison entre A et T = ?
Liaison entre G et C = ?
*Influence au niveau de ?
Double liaison Triple liaison (plus forte)
la dénaturation de l’ADN
La ?, aussi appelée duplication de l’ADN, est le processus au cours duquel l’ADN est synthétisé.
réplication de l’ADN
Technique qui permet d’obtenir rapidement de très nombreuses copies d’un segment d’A.D.N. = ?
polymérisation
Ensemble du matériel génétique d’un être vivant donné, qui regroupe les séquences codantes (gènes) et les séquences non codantes = ?
génome (sous forme d’ADN double brin la plupart du temps)
