Labo 10 : Électrophorèse des protéines

Question 1

Technique de séparation de particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique = ?

Answer 1

électrophorèse

Question 2

Vitesse de migration en électrophorèse dépend de...
V= vitesse de déplacement de l'ion
E = ?
q = ?
f = ?
Équation ?

Answer 2

E = potentiel de champ électrique (volts)
q = charge portée par l'ion
f = coefficient de friction (variable dépendante de la masse, de la forme et de la viscosité du milieu)

V = E x q / f

Question 3

Gel de polyacrylamide
Mélange de ? et ? (toxicité?)
Utilisation : séparer ? et ?
Gel non ? et inerte
Conditions ? ou ?

Answer 3

de bis-acrylamide et d’acrylamide (toxique pour le système nerveux alors port de gants nécessaire)

Séparer acides nucléiques de petites tailles et protéines

chargé

dénaturantes ou non dénaturantes (natives)

Question 4

Polymérisation (formation longues chaînes linéaires)
Acrylamide seul :
Acrylamide et agent réticulant :

Answer 4

Plusieurs chaînes non reliées

Chaînes sont toutes reliées, formation gel poreux

Question 5

La taille des pores du gel dépend de : (2)

Answer 5

• % total d’acrylamide et de bis-acrylamide (plus il est élevé, moins il va séparer des grosses molécules)
• proportion acrylamide/bis-acrylamide

Question 6

Lors de la séparation de protéines sur gel d’acrylamide, un pourcentage plus bas va faire migrer ?

Answer 6

plus rapidement, plus espacé

Question 7

Polymérisation du gel d’acrylamide
Des ? sont nécessaires à la polymérisation…
Fournis par ? qui sert d’initiateur à la réaction

Le ? est aussitôt rajouté au mélange afin d’accélérer la réaction de polymérisation.

Couler le gel immédiatement! (polymérisation rapide)

Answer 7

radicaux libres

le persulfate d’ammonium

TEMED

Question 8

Les 3 principaux types d’électrophorèse pour l’analyse des protéines :

Answer 8

• Électrophorèse en conditions non dénaturantes = natives
• Électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
• Électrophorèse à 2 dimensions (2D) : électrophorèse par isofocalisation (1ere dimension) puis SDS-PAGE deuxième dimension

Question 9

Électrophorèse en conditions natives (non dénaturantes)
La séparation dépend de ?, ? et ?
Privilégié lorsque ?
Études structurales, fonctionnelles, enzymatiques

Answer 9

la charge nette, la structure et la taille
*Pour la charge, la protéine chargée + va migrer vers la cathode alors que la protéine chargée - va migrer vers l’anode

structure de la protéine doit être conservée

Question 10

Le point isoélectrique (pI) correspond au pH pour lequel ?
Protéine est chargée positivement quand ?
Protéine est chargée négativement quand ?

*À un pH donné, les protéines n’ont pas toutes la même charge ni la même intensité de charge.

Answer 10

la somme des charges + et - d’une protéine s’annule (charge nette est nulle)
le pH est en bas de son pI
le pH est en haut de son pI

Question 11

Électrophorèse en conditions dénaturantes
Uniformisation de la forme et de la densité de charge avec un détergent anionique = ?
Séparation selon ?
Cela permet de déterminer masse moléculaire apparente des protéines, le nombre de sous-unités et pureté d’un échantillon.

Answer 11

SDS-PAGE

masse moléculaire uniquement

Question 12

Rappel des structures d’une protéine ?

Answer 12

Primaire : séquence acides aminés
Secondaire : hélice alpha, feuillet B, boucle
Tertiaire
Quaternaire

Question 13

Dénaturation d’une protéine : réversibilité?, agents dénaturants ?, perte structures?

Dégradation d’une protéine : réversibilité?, agent dégradant?, perte structures ?

Answer 13

réversibilité possible
chaleur, pH, …
perte structures tertiaires et quaternaires

non réversible
protéase (coupe prot)
perte structure primaire (alors toutes les autres aussi)

Question 14

Agents dénaturants pour les protéines :
(4)
*Afin de compléter dénaturation, on a besoin également d’un court traitement à la chaleur, généralement 90-100 degrés

Answer 14

• Chaleur et pH (déplient et linéarise molécules)
• SDS : recouvre les molécules de charges négatives (1,4 g de SDS/g de protéine, 1 SDS pour 2 acides aminés, il en faut beaucoup!!) donc densité de charge uniforme et formation complexe (bâtonnets chargés négativement)
• B-mercaptoéthanol + chaleur : rupture ponts disulfures formés entre les résidus, réducteur très utile, intra-peptide et interpeptide

Question 15

SDS-PAGE
2 sortes de système

Les 2 gels et leur tampon?

Answer 15

• Système continu : un seul gel de polyacrylamide et un seul système de tampon… pas bonne séparation… pas vraiment utilisé
• Système discontinu : superposition de 2 gels de polyacrylamide, gel de concentration/empilement (2-4%) et gel de résolution/de séparation (7-15%)
  2 tampons de pH différent
  Permet de concentrer les échantillons en une fine bande, pour une meilleure résolution

Gel d’empilement avec Tris-HCl pH 6,8
Gel de séparation avec Tris-HCl pH 8,8

Question 16

Principe électrophorèse en système discontinu
Vitesse migration selon gel...
Glycine?
Ions Cl-?
Protéines ?

Answer 16

À pH de 6,8 (gel d’empilement), Cl- rapides et premiers, ensuite protéines et après glycine (lents)
À pH 8,8 (gel de séparation), ions glycines deviennent chargées négativement et puisqu’elles sont plus petites, elles dépassent les protéines et migrent plus rapidement

Question 17

Méthodes de détection des protéines du plus sensible au moins sensible
*Sensibilité = quantité minimale protéine détectable)

Answer 17

Radiographie (20 ppm)
Coloration à l'or colloidal (moins de 1 ng)
Coloration au nitrate d'argent (4 ng)
Coloration au bleu de Coomassie (40 ng)
Coloration au rouge ponceau (100 ng)

Question 18

Détermination de la taille des protéines par électrophorèse…
Marqueur ?
Graphique ?

Answer 18

Marqueur Standard Broad Range

Log de la masse moléculaire en fonction de la distance de migration (moins prot migre, plus elle est grosse)

Question 19

Étapes principales purification d’une protéine…

Answer 19

1. Homogénéisation pour extrait protéique brut
2. Étapes de purification grossières
   3, 4, 5. Chromatographie

Question 20

De quoi sont formés les IgGs?

Answer 20

2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères, toutes liées par des ponts disulfures

Question 21

Électrophorèse à 2 dimensions (2D)

1. Électrophorèse par isofocalisation = ?
2. SDS-PAGE = ?

Answer 21

Série d’ampholytes pour créer gradient de pH puis chaque protéine arrête de migrer lorsque pH=pI (de pH 9 (en haut, donc -) à pH de 3 (en bas, donc +)

migrent selon taille moléculaire (grosses avancent pas bcp, petites oui)

Question 22

Quel réactif inhibe la réaction de polymérisation d’un gel de polyacrylamide ?

Answer 22

L’oxygène (air)