Labo 8-9-10-11 Flashcards
Quel est l’objectif scientifique du chapitre 8 : Solation et purification de l’ADN total de cellules en culture ?
Isoler et purifier les ARN totaux d’une lignée cellulaire du cancer du sein humaine en culture
Quelle est l’approche méthodologique du chapitre 8 : Solation et purification de l’ADN total de cellules en culture ?
Comparer deux techniques d’isolation : précipitation et colonne
Quels sont les 3 types d’ARN qui assurent la fonction des synthèses de protéines ?
- ARNm
- ARNt
- ARNr
Quelle technique avons-nous utiliser afin d’étudier les niveaux d’expression des gènes ?
RT-PCR
Pourquoi l’ARN est plus difficile à étudier que l’ADN ?
Car l’ARN est plus vulnérable vis-à-vis les RNase A et la chaleur (pour cette raison qu’il faut que les manipu soient fait dans un environnement stérile)
Quel est le principe de l’extraction de l’ARN total par précipitation ?
Elle exploite de le fort pouvoir dénaturant de l’isothiocyanate de guanidine, ce qui provoque la lyse des cellules et inhibe les RNases libérées
Dans la méthode de précipitation, les cellules sont lysées grâce à quoi ?
TRIzol QUI CONTIENT :
1. Isothiocyanate de guanidine
2. Phénol
Comment l’ARN est extrait dans la méthode de précipitation ?
Grâce au chloroforme, qui entraîne la séparation du mélange en 2 phases après centrifugation
Que retrouve-t-on dans les 3 phases d’une méthode d’extraction par précipitation ?
- Phase aqueuse: ARN
- Interphase : ADN
- Phase organiques : protéines + lipides + chloroforme + phénol
Lorsque que la phase aqueuse est récupérée, l’ARN est précipité avec quoi ?
Alcool froid (isopropanol)
Quelles sont les étapes de la purification sur colonne ?
- Homogénéiser les cellules ou le tissu avec le mélange isothiocyanate de guanidine-phénol
- Déposer l’échantillon sur colonne
- Centrifuger
- Laver
- Traiter l’ARN au DNase
- Laver
- Éluer
- Doser
Entre la méthode de précipitation et de colonne, laquelle nous permet d’avoir un ARN de plus haute qualité ?
Colonne
Qu’est-ce que le DEPC ?
Eau ayant été traitée avec un inhibiteur de RNase
Quel est le % d’éthanol utilisé pour la précipitation ?
éthanol 75%
L’ajout d’H2O-DEPC sur l’ARN sert à quoi ?
Hydrater l’ARN
À quoi sert un tampon de prélavage d’ARN dans la méthode de la colonne ?
Prépare au lavage:
1. Nettoie la colonne
2. Améliore pureté
3. Réduit les contaminants
Parmi les ARN totaux, lequel nous intéresse ?
ARNm
Quelles sont les étapes de la méthode de précipitation ?
PRÉCIPITATION :
1. Lyse des cellules : Ajout de TRIzol (ou phénol + guanidinium) pour lyser et dénaturer protéines/ADN
2. Phase séparation: Ajout de chloroforme, puis centrifugation : séparation en 3 phases
- Phase aqueuse = ARN
- Phase interphase = ADN
- Phase organique = protéines
3. Récupération de l’ARN: Prélèvement de la phase aqueuse contenant l’ARN
4. Précipitation de l’ARN: Ajout d’isopropanol ou d’éthanol → formation d’un pellet d’ARN
5. Lavage: Lavage du pellet avec éthanol 70% pour enlever les impuretés
6. Resuspension: Séchage rapide puis resuspension de l’ARN dans de l’eau ou tampon (RNase-free)
Quelles sont les étapes de la méthode de colonne ?
- Lyse des cellules: Tampon de lyse contenant un dénaturant (ex. : guanidinium) + β-mercaptoéthanol
- Homogénéisation: Passage dans une seringue/filtre ou vortex avec bille pour homogénéiser
- Fixation à la colonne: Ajout d’éthanol → la solution est chargée sur une colonne à membrane de silice
- (Facultatif) Pré-lavage: Tampon de pré-lavage pour éliminer contaminants bruts
- Traitement DNase I Ajout sur colonne pour digérer l’ADN génomique (sans libérer l’ARN)
- Lavage: Plusieurs lavages avec des tampons contenant éthanol pour éliminer les impuretés
- Élution: ARN est éluté avec de l’eau ou un tampon sans RNase
Quelle est la différence entre l’isopropanol 99% et l’éthanol froid 75% ?
Isopropanol 99% :
- précipitation rapide de l’ARN
- juste après phase aqueuse
Éthanol 75% :
- Élimine les sels/impuretés
- Après centrifugation
Quelle méthode entre la précipitation et la colonne assure un meilleure rendement ?
Précipitation
À l’étape 16 de l’isolation de l’ARN par la méthode de la précipitation, bien que le microtube contienne un culot d’ARN, on le laisse ouvert et à la température de la pièce. Pourquoi prend-on ce risque?
Pour évaporer l’éthanol résiduel, car il inhibe fortement la Taq polymérase
Dans la méthode d’isolation de l’ARN sur colonne, pourquoi fait-on un traitement avec de la DNAse I alors que dans la méthode d’isolation par précipitation, on ne le fait pas?
Parce que dans la méthode de la colonne, l’ADN co-purifie très facilement avec l’ARN. Tandis qu’avec la méthode de précipitation, cette méthode sépare naturellement l’ADN.
Quel est l’objectif spécifique du chapitre 9 : Analyse de l’intégrité des ARN sur gel d’agarose ?
Analyser l’intégriter des deux échantillons d’ARN totaux extraits par les deux méthodes
Les molécules d’ARN sont chargés comment ?
négativement
Pourquoi l’ARN doit être séparé en utilisant des conditions de dénaturation ?
Car certains ARN peuvent former des liaisons db.
Quel agent dénaturant d’ARN est utilisé lors de l’électrophorèse de l’ARN ?
Formaldéhyde
Quelles sont les fonctions du formaldéhyde ?
- Dénaturant des ARN
- Protège contre la dégradation des ARN
À quoi sert le formide ?
Protéger contre la dégradation des ARN
À quoi sert le MOPS 10X ?
Pour maintenir un pH optimal et stable + favorise une bonne migration et empêche sa dégradation.
Analyser les résultats de la migration sur électrophorèse des différentes sous-unités de l’ARN.
Diapo examen final 33 ou cahier page 90
Quel est le rôle de l’étape de chauffage dans la préparation des ARN à 65˚C pendant 5 min avant de les déposer sur gel ?
Pour bien assurer de dénaturer les structures secondaires des ARN.
Quel est l’objectif spécifique du chapitre 10 : Rétro-transcription ?
Préparer une banque d’ADNc
Qu’est-ce que la rétro-transcription ?
Synthèse d’un brin d’ADNc à partir d’une séquence d’ARN
Quelles sont les 2 étapes principales de la réaction de RT ?
- Hybridation des amorces Oligo dT à la région 3`des ARNm contenus dans l’isolat de l’ARN total
- Synthèse d’un brin d’ADNc à chacun des ARNm
Avec quel outil se fait la polymérisation de ADNc ?
PCR
Quelles amorces sont utiliser afin d’amplifier uniquement les ARNm ?
polyT qui vont se lier aux extrémités de polyA.
Quelles sont les 2 S-U des ARNr ?
28S et 18S
Les ARNm constituent combien de % de la cellule ?
1-5 %
Quel ARN est le plus nombreux ?
ARNr (75% de la cellule)
Comment se fait l’extraction de l’ARNm ?
Une matrice composée de oligodT qui retiendra les queues poly A
Quelle est l’utilité du PCR ?
Produire une grand quantité d’un fragment d’ADN précis à partir d’une petite quantité
Quelles sont les 3 étapes de l’amplification d’ADN par PCR ?
- Dénaturation de l’ADN (95°C)
- Hybridation des amorces à l’ADN matrice (65°C)
- Polymérisation de l’ADN (72°C)
Quelle est la polymérase utilisée lors de la PCR ?
Taq polymérase isolée à partir de Thermus aquaticus
Pourquoi dans le PCR, on utilise du magnésium ?
Car c’est un cofacteur enzymateur et aide à l’activité de la Taq polymérase
Pourquoi on chauffe l’oligodT lors d’un RT-PCR ?
Pour favoriser l’hybridation spécifique d’oligodT et polyA
À quoi sert les dNTPs ?
Fournissent les bases nécessaires à la synthèse de l’ADN
La RT est dépendante de quoi ?
des amorces et des matrices
Pour un RT-PCR, quels sont les gènes « domestiques » utilisés pour la normalisation des données ?
- ß-actine
- GAPDH
Qu’est-ce que l’enzyme MMLV-RT ?
Enzyme transcriptase inverse
Pendant la préparation de la rétrotranscription, à l’étape 3, on insiste sur l’importance de garder les échantillons à la température pièce et non sur glace, bien qu’ils contiennent de l’ARN. Pourquoi prend-on ce risque?
Pour permettre aux amorces de s’hybrider à l’ARN
Quels sont les 2 types de matériels à amplifier dans le PCR ?
- ADN
- ADNc
À quel cycle, les premiers amplicons apparaissent ?
3e cycle
Qu’est-ce qu’un Master mix ?
Un grand mélange réactionnel qui contient tous les réactifs de l’étape de l’amplification (Taq polymérase, amorces, dNTPs, MgSO4, DEPC, Tampon PCR)
Combien de cycle de PCR avons-nous fait ?
26
Dans le mélange réactionnel pour la PCR (étape 4), on inclut du MgSO4. À quoi servira le sulfate de magnésium dans la réaction?
Le sulfate de magnésium (MgSO₄) fournit des ions Mg²⁺, qui sont essentiels au bon fonctionnement de l’ADN polymérase pendant la PCR.
Dans la réaction de PCR, on inclut des dNTPs. Est-ce qu’ils sont exactement de même nature que ceux qui sont utilisés pour la réaction de RT?
Oui, mais leur contexte sont différents.
En RT, la reverse transcriptase utilise les dNTPs pour synthétiser un ADNc à partir d’un ARN.
En PCR, la Taq polymérase utilise les dNTPs pour amplifier un brin d’ADN.
Nommer deux ingrédients actifs du tampon PCR 10X et énoncer leur rôle dans la réaction de PCR.
- Tris-HCl (tampon pH: maintien pH stable)
-KCl (stabilise hybridation des amorces à l’ADN matrice)
Quelle méthode est la plus pure ?
Colonne a moins de contaminants, car c’est traité avec DNase I
Analyser les résultats du chapitre 11.
Diapo 38 examen final
