3. Spectrophotométrie UV-visible Flashcards
Le BioPhotometer est utilisé pour mesurer quoi ?
Les bactéries, mais aussi les acides nucléiques
Le Nanodrop est utilisé pour mesurer quoi ?
Les acides nucléiques seulement
Quel est le principe de la spectrophotométrie UV-visible ?
Basée sur la mesure de l’interaction entre une matière qu’on veut étudier et la lumière qui la frappe.
Qu’est-ce que le monochromateur ajustable laisse passer ?
Une seule longueur d’onde
Par quelle propriété les acides nucléiques sont mesurés ?
Leur propriété d’absorption des photons à une longueur d’onde précise (260nm)
Plus la solution d’ADN ou d’ARN à étudier est de concentration élevée, plus son absorbance à 260nm sera … ?
Élevée
Par quelle propriété les bactéries en suspension dans un échantillon sont mesurées ?
Par leur propriété à dévier les photons d’une longueur d’onde précises (600nm)
Plus la densité bactérienne de la solution est élevée, moins la quantité de lumière qui réussira à atteindre le détecteur sera … ?
élevée
V ou F : La densité optique est une mesure de l’absorbance.
Faux
Qu’est-ce que la densité optique ?
Une mesure de la réduction de la transmittance causée par la déviation des photons.
Quel volume on peut analyser à l’aide d’un Nanodrop ?
Des volumes aussi peu que 1,5µL de préparation d’ADN ou d’ARN.
Qu’est-ce qu’il faut faire avant d’analyser un échantillon inconnu par Nanodrop ?
Faire le blanc/zéro/blank = Faire mesurer par l’appareil la DO du liquide dans lequel sont resuspendus des acides nucléiques pour les échantillons inconnues.
Pourquoi le BioPhotometer est versatile ?
Car il permet de mesurer autant des acides nucléiques d’un échantillon que la densité des suspensions bactériennes
L’appareil Nanodrop affiche quoi après sa lecture ?
La concentration nette en acides nucléiques (ng/µL) qu’il indique à partir de la DO à 260nm (loi de Beer-Lamber est déjà appliqué)
L’appareil BioPhotometer affiche quoi après sa lecture ?
Pour des acides nucléiques, il affiche la DO à 260nm qu’il a mesurée (donc, n’affiche pas la concentration des acides nucléiques à laquelle cette DO correspond) (loi de Beer-Lambert doit être calculer)
Que signifie un affichage d’une DO à 230nm par le BioPhotometer ?
Évaluation des composés organiques dans l’échantillon (phénol, EDTA, isothiocyanate de guanidine, alcools, Triton X-100, glycoprotéines, protéoglycans)
Que signifie un affichage de 280nm par le BioPhotometer ?
Proportion de protéines dans l’échantillon
Comment calculer la concentration d’un échantillon d’acide nucléique, si seulement la DO est mesurée ?
En utilisant, la loi de Beer-Lambert
Quelle est la loi de Beer-Lambert ?
A = e x c x l
A : absorbance à 260nm
e : coefficient d’extinction
c : concentration
l : trajet optique
Combien de coefficient d’extinction existe ?
3 (ADN db, ARN et ADN sb comme ADNc)
V ou F : L’absorbance varie de façon proportionnelle à la concentration de l’acide nucléique.
Vrai
Selon la loi de Beer-Lambert, quels sont les unités de mesure de la concentration calculée ?
ng/mL ou ng/µL
V ou F : Si l’échantillon a été dilué, pour connaître la concentration réelle, il faut multiplier la concentration affichée par l’appareil par le facteur de dilution utilisé.
Vrai
À quoi correspond le trajet optique ?
La largeur de la cuvette
Qu’est-ce qu’on doit calculer pour évaluer la proportion de matière organique par rapport aux acides nucléiques dans un échantillon d’ADN ?
Calcul du ratio DO260/230
Qu’est-ce qu’on doit calculer pour évaluer la proportion de protéines par rapport aux acides nucléiques dans un échantillon d’ADN ?
Calcul du ratio DO260/280
Pour que l’échantillon soit considéré suffisamment pur/libre de matières organiques et que l’ADN soit utilisable, quel est le ratio accepté ?
entre 2.0 et 2.2
Pour que l’échantillon soit considéré suffisamment pur/libre de protéines et que l’ADN soit utilisable, quel est le ratio accepté ?
entre 1.75 et 2.1
V ou F : En mesurer la DO des bactéries en suspension, il faut bien mélanger.
Vrai
Que signifie une DO600 de l’aliquot bactérien entre 0.3 et 0.8 ?
Les bactéries sont en phase logarithmique de croissance, c’est à cette phase qu’on induit l’expression de gènes.
Que signifie une DO600 de l’aliquot bactérien inférieure à 0.3 ? ?
La densité de la suspension bactérienne est insuffisante, alors on remet la culture bactérienne liquide dans l’incubateur.
Que signifie une DO600 de l’aliquot bactérien supérieure à 0.8-0.9 ?
La suspension peut être adéquate pour des applications telles que les extractions d’ADN plasmidique,
MAIS elle est trop dense pour la transformation bactérienne, alors on doit diluer la préparation bactérienne liquide d’un facteur minimal de 2.
V ou F : La lumière qui passe dans une sln d’ADN est absorbée, et non diffusée comme c’est le cas des bactéries.
Vrai
Quelle sln est utilisée pour faire le blanc pour des échantillons d’ADN ?
Tampon d’élution (EB)
Quelle solution est utilisée pour faire le blanc pour des suspensions bactériennes ?
Bouillon LB
Combien de mL de suspension bactérienne, il faut mettre dans la cuvette en plastique ?
1mL
Que signifie un ratio 260/280 plus basse que 1.75 ?
Possible contamination par des protéines ou autres impuretés
Que signifie un ratio 260/280 plus haut que 2.1 ?
Possible contamination par des acides nucléiques très purs ou des inhibiteurs organiques (comme le phénol0
Que signifie un ratio 260/230 plus basse que 2.0 ?
Possible contamination par des solvants organiques, résidus de phénol ou autres produits chimiques utilisés dans l’extraction de l’ADN
Que signifie un ratio 260/20 plus haut que 2.2 ?
Exempt de contaminations organiques, donc très pur
