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Labo ADN > 1. Théorie clonage moléculaire > Flashcards

1. Théorie clonage moléculaire Flashcards

1
Q

Quelle est la définition du terme « clonage » en biologie moléculaire ?

A

Ensemble des étapes nécessaire à la production d’une molécule d’ADN recombinante.

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Q

Qu’est-ce qu’une molécule d’ADN recombinante ?

A

Une molécule issue de la ligation d’un fragment d’ADN exogène (d’une origine différente) avec une molécule d’ADN réceptrice (un vecteur de clonage).

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3
Q

Qu’est-ce qu’un ADN chimère ?

A

Une molécule d’ADN composée de segments provenant de deux sources génétiques distinctes.

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4
Q

Que se passe-t-il après la création d’une molécule d’ADN chimère ?

A

Elle sera reproduite pour mener à l’apparition d’un grand nombre de copies de molécules d’ADN identiques. Ces nombreuses copies seront des « clones » de la molécule chimère d’origine.

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Q

Quelles sont les utilités du clonage moléculaire ? (3)

A
  1. Analyser le rôle d’un fragment d’ADN
  2. Analyser le fonctionnement d’un gène
  3. Produire la protéine correspondante dans un organisme différent.
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6
Q

Donner un exemple de clonage moléculaire et expliquer le principe.

A

L’obtention d’une grande quantité d’insuline en insérant le gène humain codant pour cette protéine dans une molécule d’ADN réceptrice d’origine bactérienne (VECTEUR). (diapo11)

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7
Q

Quel pays a découvert l’insuline ?

A

Canada

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8
Q

À l’aide d’un schéma, comment fonctionne le clonage moléculaire et la production des protéines recombinantes.

A

A) Le gène humain de l’insuline ainsi qu’une molécule d’ADN réceptrice d’origine bactérienne sont coupés, isolés, puis collés ensemble.

B) La construction d’ADN est introduite dans la bactérie, qui permet la multiplication de la molécule d’ADN et la production d’une grande quantité d’insuline.

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9
Q

Quelles sont les 2 particularités chez le génome eucaryote ?

A
  1. L’épissage/maturation du brin d’ADN:
    - élimination des introns
    - ajout de la coiffe en 5’
    - ajout queue polyA en 3’
  2. Usine à production de protéines fonctionnelle:
    - ponts disulfures
    - conformation
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10
Q

Quelles sont les grandes étapes de la réalisation d’un clonage moléculaire ? (5)

A
  1. Élaboration d’une stratégie de clonage
  2. Digestion et purification du vecteur et de l’insert digérés
  3. Ligation de l’insert avec le vecteur
  4. Transformation de la bactérie avec le produit de ligation
  5. Sélection/criblage et identification des transformants (clones) contenant la construction recherchée.
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11
Q

Rappel : Comment se nomme la liaison qui lient les nucléotides entre-eux ?

A

Liaison phosphodiester entre le carbone 5’ d’un ose (sucre) et le carbone 3’ de l’ose (sucre) adjacent.

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12
Q

Quelles sont les règles de lecture des brins d’ADN ? (2)

A
  1. Une extremité contient le groupement phosphate en 5’ sur l’ose : extremité 5’P.
  2. Une extremité contient un OH libre en 3’ sur l’ose : extremité 3’OH.
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13
Q

V ou F : Une chaîne d’acide nucléique se lit toujours dans le sens 5’P vers 3’OH ?

A

Vrai

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14
Q

Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction ?

A

Une endonucléase capable de reconnaître et de couper une liaison phosphodiester d’une séquence spécifique à l’intérieur de la double hélice d’ADN.

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15
Q

V ou F : La séquence d’ADN méthylée est beaucoup plus à l’abris des enzymes de restrictions qu’une séquence d’ADN déméthylée ?

A

Vrai

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16
Q

Qu’est-ce qu’une séquence d’ADN méthylée ?

A

Ajout du groupement méthyl (-CH3)

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17
Q

Que signifie le terme «digestion» ?

A

Coupure par une enzyme de restriction

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18
Q

Quelle est la nomenclature des enzymes de restriction ?

A
  1. Genre et espèce de l’organisme
  2. Souche de l’organisme
  3. Ordre de découverte

Ex: EcoR1 ou HindIII

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19
Q

V ou F : Les enzymes de restriction font également partie du système de défense bactérien.

A

Vrai, car elles reconnaissent une signature étrangère (ADN non méthylée)

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20
Q

Quelle est l’utilité des enzymes de restriction?

A

Construction de molécules d’ADN recombinantes. En effet, elles permettent de «couper» l’ADN en fragments qui peuvent être ensuite «collés» ensemble dans différentes combinaisons, selon les besoins de l’expérience.

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21
Q

Quelles sont les principales applications des enzymes de restriction ?

A

Détections de certaines mutations ou maladies.

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22
Q

Quels sont les sites de reconnaissance que reconnaissent les enzymes de restriction ?

A

Les enzymes de restriction reconnaissent des séquences spécifiques allant de 4 à 16 nucléotides.

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23
Q

Quels sont les séquences spécifiques reconnues par les enzymes de restriction ?

A

Séquences palindromiques, c’est-à-dire des mots qui peuvent être lus indifféremment de gauche à droite ou de droite à gauche.

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24
Q

Quel est le site de reconnaissance des enzymes de restriction pour une séquence d’ADN double brins?

A

Séquence de nucléotides identique de 5’ en 3’ sur les deux brins.

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25
Q

V ou F : Lorsque l’on digère une molécule d’ADN, même si celle-ci est circulaire au départ, il y a création d’extrémités libres.

A

Vrai

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26
Q

Quelles sont les 3 types de molécules produites à la suite de la digestion d’une enzyme de restriction?

A
  1. avec une extremité 3’ saillante,
  2. avec une extremité 5’ saillante,
  3. à bouts francs (aucun bouts qui dépasse)
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27
Q

Si une enzyme de restriction reconnaît une séquence de 6 nucléotides et que son site de coupure se situe en plein centre de cette séquence, comment l’ADN sera coupé ?

A

L’ADN sera coupé en deux de façon «franche», donc aucune base d’ADN qui dépassera.

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28
Q

Si une enzyme de restriction reconnaît une séquence de 6 nucléotides et que son site de reconnaissance ne se situe pas au centre, comment l’ADN sera coupé ?

A

Il y aura création d’extrémités simple brin en 5’ ou en 3’. Ces extrémités sont «cohésives» et peuvent être «recollées» ensemble, par une ADN ligase.

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29
Q

Schématiser les séquences palindromiques reconnues par les enzymes de restriction EcoRI, SmaI et PstI.

A

Diapo 20

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30
Q

Qu’est-ce qu’une ADN ligase ?

A

Enzymes capables de reconstituer la liaison phosphodiester de façon covalente entre le 5’P et le 3’OH de deux nucléotides adjacents d’un brin d’ADN.

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31
Q

Donner un exemple d’ADN ligase fortement utilisée en laboratoire.

A

Ligase d’ADN du phage T4

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32
Q

V ou F : La ligation d’ADN peut se faire entre deux extrémités franches ou entre des extrémités saillantes complémentaires qui s’imbriquent l’une dans l’autre.

A

Vrai

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33
Q

Expliquer et schématiser la recombinaison des bouts adhésifs digéré par EcoRI.

A

Diapo 22

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34
Q

Qu’est-ce qu’une plasmide ?

A

Une molécule circulaire d’ADN double brin, présentes à l’état naturel dans le cytoplasme de bactéries. (ADN extra-chromosomique)

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35
Q

Comment les plasmides se répliquent-ils ?

A

De façon autonome, donc indépendamment des chromosomes de la bactérie.

36
Q

V ou F : Les plasmides peuvent avoir d’autres gènes qui peuvent leur conférer des propritétés particulières à la cellule réceptrice.

A

Vrai, comme les plasmides qui contiennent le gène de résistance à un antibiotique.

37
Q

Quelle est l’utilité que le plasmide possède un gène de résistance à un antibiotique ou à des métaux lourds ?

A

Cela permet à la cellule hôte sensible à ces agents de survivre en présence de ces composés toxiques.

38
Q

Quelles sont les différences de taille entre le chromosome circulaire et le plasmide circulaires ?

A

Chromo circulaire = 4-6 x10^6
Plasmide circulaire = 3-6 x10^3

Donc, le chromo circulaire est nettement plus gros que le plasmide circulaire.

39
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur de clonage ?

A

Une molécule d’ADN qui a été contruite pour accueillir des fragments exogènes, qu’on appelle des «inserts».

40
Q

Quel est le rôle des vecteurs de clonage ?

A

Transporter des fragments d’ADN d’intérêt, d’où son nom « vecteur».

41
Q

Quels sont les vecteurs utilisés la plupart du temps ?

A

Plasmides naturels qui ont été modifiés pour répondre aux besoins des expériences de biologie moléculaire.

42
Q

Quelles sont les composantes de base d’un vecteur de clonage et leur rôle?

A
  1. Origine de réplication (Ori) = permet au vecteur de se répliquer de manière autonome dans la cellule hôte.
  2. Site de clonage multiple (SCM) = contient plusieurs sites de reconnaissance pour des enzymes de restriction.
  3. Marqueur ou gène de sélection (gène de résistance à un antibiotique) = pour savoir quelles cellules bactériennes ont incorporé une copie du vecteur.
  4. Promoteur = Permet l’expression du gène inséré en dirigeant l’ARN polymérase vers le début du gène.
  5. Marqueur de criblage : permet d’identifier les colonies qui possèdent la construction d’ADN plasmidique recherchée.
43
Q

Quelles sont les marqueurs de sélection les plus utilisés dans les vecteurs de clonage et donner un exemple ?

A

Les gènes de résistance aux antibiotiques

Ex. Gène ß-lactamase, responsable de la résistance à l’antibiotique ampicilline

44
Q

Quel est l’avantage d’un site de clonage multiple ?

A

Faciliter l’introduction dirigée de fragments d’ADN exogènes dans le vecteur.

45
Q

V ou F : Chacun des sites de reconnaissance du SCM doit être unique dans le vecteur de clonage.

A

Vrai, car s’ils se trouvent ailleurs la digestion du vecteur avec l’enzyme correspondantes couperait le vecteur plusieurs fragments.

46
Q

Si jamais le vecteur possède plusieurs sites de reconnaissance pour la même enzyme de restriction, quelle serait la solution ?

A

Mutagénèse dirigée

47
Q

Pourquoi la combinaison de marqueur de sélection-criblage est essentielle dans le clonage moléculaire ?

A

Elle permettra d’identifier non seulement les cellules ayant incorporé les vecteurs (croissance sur le milieu contenant l’antibio), mais aussi celles comportant un vecteur qui contient un insert (couleur différente).

48
Q

Quel est le marqueur de criblage le plus utilisé ?

A

Gène LacZ de l’opéron lac

49
Q

Quels gènes sont inclus dans l’opéron lac ?

A

L’opéron lac contient les gènes lacZ, lacY et lacA.

50
Q

Quelle est la fonction du gène lacZ dans l’opéron lac ?

A

Le gène lacZ code pour la β-galactosidase, une enzyme qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose.

51
Q

Quels sont les trois sites régulateurs de l’opéron lac ?

A

Le promoteur, l’opérateur et le site CAP.

52
Q

Dans quelles conditions l’opéron lac est-il exprimé ?

A

L’opéron lac est exprimé lorsque le lactose est disponible et le glucose est absent.

53
Q

Quel rôle joue l’allolactose dans la régulation de l’opéron lac ?

A

L’allolactose agit comme un inducteur en inhibant le répresseur Lac, permettant la transcription de l’opéron.

54
Q

Qu’est-ce que le système de criblage avec le gène lacZ ?

A

Le système utilise la β-galactosidase pour différencier les colonies : bleues (sans insert) ou blanches (avec insert).

55
Q

Pourquoi les colonies contenant un insert dans le SCM apparaissent-elles blanches ?

A

L’insert interrompt la traduction du peptide alpha, rendant la β-galactosidase non fonctionnelle.

55
Q

Quels sont les substrats et inducteurs utilisés pour le criblage avec lacZ ?

A

Le X-gal (substrat) et l’IPTG (inducteur).

56
Q

Pourquoi E.coli est un outil de manipulations de base en biomol ?

A
  • Préparer de l’ADN plasmidique en petite ou en grande quantité
  • Pour produire des protéines recombinantes
57
Q

Quels sont les 2 avantages d’utiliser E.coli ?

A

1- Par simplicité, rapidité et la facilité des manipulations.
2- Temps de division est très court = 20min vs les cellules humaines qui se divisent environ une fois en 24h

58
Q

Que veut-dire la transformation d’une bactérie par un plasmide ?

A

Action d’introduire de l’ADN plasmidique (vecteur) dans une bactérie.

59
Q

Quel est le but d’une transformation d’une bactérie par un plasmide ?

A

Obtenir une grande quantité de l’ADN en question. En effet, à la suite d’une transformation, la bactérie répliquera l’ADN plasmidique reçu comme s’il s’agissait de son propre ADN.

60
Q

Quels sont les 2 méthodes principales permettant de transformer une bactérie avec de l’ADN ?

A
  1. Transformation par la chaleur (méthode chimique)
  2. Électroporation (méthode physique)
61
Q

Quel est la condition afin de réussir une transformation d’une bactérie par un plasmide ?

A

Il faut que les bactéries soient «compétentes», soit aptes à laisser entrer l’ADN plasmidique. Normalement, on les achète.

62
Q

Schématiser comment s’effectue la sélection d’une bactérie transformée ?

A

Diapo 47

63
Q

Quelle souche d’E. coli faut-il utiliser dans le cadre d’un clonage ?

A

Des souches qui ne peuvent pas méthyler

64
Q

Pourquoi nous devons utiliser des souches d’E.coli qui ne peuvent méthyler l’ADN ?

A

Pcq la méthylation sert à protéger le génome bactérien contre les coupure par ses propres enzymes de restriction.

65
Q

Quelle serait la conséquence d’utiliser une souche bactérienne pouvant méthyler ?

A

Si on amplifie l’ADN plasmidique dans une souche ayant cette activité-là, celui-ci sera méthylé sur certaines bases. Ainsi, l’ADN plasmidique extrait de cette bactérie ne pourra être digéré par les enzymes de restriction incapables de digérer l’ADN méthylé.

66
Q

Quelles activités des souches bactériennes seront diminuer si il y a présence de mutations ?

A
  1. Recombinaison = éviter l’intégration des plasmides dans le génome bactérien
  2. Activation des endonucléases = éviter de dégrader les plasmides introduits.
67
Q

Sélection criblage d’une bactérie

A

diapo 49-50

68
Q

Quels sont les étapes de l’extraction de l’ADN plasmidique ? (6)

A
  1. Mise en culture
  2. Lyse bactérienne
  3. Neutralisation
  4. Purification
  5. Lavage et élution
  6. Dosage par spectrophotométrie.
69
Q

Comment on visualise de l’ADN sur gel d’agarose ?

A

Avec des produits fluorescents = bromure d’éthidium

70
Q

Comment le bromure d’éthidium devient fluorescent ?

A

Ce produit s’intercale entre les bases de la double hélice et devient fluorescent quand il est excité par des rayons UV.

71
Q

Qu’est-ce qu’un insert ?

A

Fragment d’ADN excisé d’un autre vecteur ou d’un fragment amplifié par PCR à partir d’ADN génomique.

72
Q

Comment procéder à l’élaboration d’une stratégie de clonage ?

A
  1. Choix des ER
    -selon une stratégie bidirectionnelle ou unidirectionnelle
  2. Choix des sites de restrictions du gène de la GFP.
  3. Choix du vecteur
    - pUC19
    -pBluescript
73
Q

Que se passe-t-il lorsque le glucose est présent en grande quantité ?

A

La protéine activatrice du catabolite (CAP) ne peut pas se lier au site CAP, ce qui réduit l’expression de l’opéron lac.

74
Q

Quel est le rôle du répresseur Lac dans l’opéron lac ?

A

Le répresseur Lac se lie à l’opérateur et empêche la transcription de l’opéron lac en l’absence de lactose.

75
Q

Comment l’ARN polymérase est-elle influencée par la liaison du répresseur Lac à l’opérateur ?

A

La liaison du répresseur Lac empêche l’ARN polymérase de transcrire les gènes de l’opéron lac.

76
Q

Pourquoi l’opéron lac est-il un bon exemple de régulation génique chez les bactéries ?

A

Il montre une régulation double, dépendante à la fois d’un inducteur (lactose/allolactose) et de l’absence de glucose.

77
Q

Que signifie le terme “complémentation alpha” dans le système lacZ ?

A

La complémentation alpha se réfère à la restauration de la β-galactosidase fonctionnelle grâce à l’interaction entre le peptide alpha produit par le vecteur et le peptide omega de la bactérie.

78
Q

Quel est l’effet de l’IPTG sur le répresseur Lac ?

A

L’IPTG est un analogue de l’allolactose qui inhibe le répresseur Lac, permettant ainsi la transcription des gènes de l’opéron lac.

79
Q

Pourquoi utilise-t-on le X-gal pour le criblage des colonies ?

A

Le X-gal est hydrolysé par la β-galactosidase en un produit bleu, permettant d’identifier les colonies qui expriment le gène lacZ intact.

80
Q

Quel est le rôle du site CAP dans l’opéron lac ?

A

Le site CAP permet la liaison de la protéine CAP activée par l’AMPc, favorisant la transcription en absence de glucose.

81
Q

Que montre la couleur bleue des colonies dans le criblage avec le système lacZ ?

A

Les colonies bleues indiquent que le gène lacZ n’a pas été interrompu, donc aucune insertion d’ADN étranger n’a eu lieu dans le SCM. Alors, cela indique que la ß-galactosidase est fonctionnelle.

82
Q

Quels sont les deux domaines fonctionnels qui composent la ß-galactosidase ?

A
  1. Peptide alpha
  2. Peptide oméga
83
Q

Pourquoi utilise-t-on des souches bactériennes mutées dans le système lacZ ?

A

Les souches bactériennes utilisées ont une β-galactosidase non fonctionnelle car elles ne produisent pas le peptide alpha.

84
Q

Comment la complémentation alpha fonctionne-t-elle ?

A

Le vecteur fournit le peptide alpha fonctionnel, qui s’associe au peptide omega de la bactérie pour restaurer une β-galactosidase active.

85
Q

Quelle est l’étape finale pour confirmer la présence de l’insert dans une colonie blanche ?

A

La confirmation se fait par séquençage pour vérifier la présence et l’orientation correcte de l’insert.

86
Q

Pourquoi les colonies blanches sont-elles importantes dans le criblage lacZ ?

A

Les colonies blanches suggèrent que le vecteur contient un insert, interrompant le gène lacZ et rendant la β-galactosidase inactive.

Labo ADN (4 decks)

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