Labo 4-5-6-7 Flashcards
Quel est l’objectif scientifique du chapitre 4 : Extraction d’ADN d’un gel d’agarose et dosage d’agarose ?
Procéder à la purification des fragments d’ADN provenant de la digestion avec les enzymes PstI et SalI du gène codant pour GFP et du vecteur pUC19.
Combien de fragments obtient-on après la digestion avec les enzymes PstI et SalI de pBS/GFP ?
2 fragments : vecteur pBS + fragment GFP
Si la digestion avec les ER est complète, combien de fragments obtient-on pour le vecteur pUC19 ?
Un seul fragment linéarisé
Pour faire fondre l’agarose, il faut chauffer le morceau à quelle température ?
50°C
Quel est le rôle du tampon de solubilisation (QG) ?
Dissoudre le gel d’agarose
Après la purification et l’extraction, à quoi servait la migration par électrophorèse sur gel d’agarose ?
Évaluer l’intensité de chaque bande d’ADN et cela va être proportionnelle à la quantité d’ADN qui la compose.
Quand on fait migrer 5µl du marqueur Massruler Express, la bande la plus haute du marqueur contient combien d’ADN en ng?
50ng, car 5x10
Quand on fait migrer 10µl du marqueur Massruler Express, la bande la plus haute du marqueur contient combien d’ADN en ng?
100 ng, car 10x10
Si l’intensité d’une bande qu’on veut doser correspond à la même intensité que la bande du marqueur Massruler Express qui contient 100ng, alors cet ADN contient combien en ng ?
100 ng d’ADN
Donc, on peut trouver la concentration de l’échantillon purifié qu’on veut doser comment ? Si la bande correspond à la même intensité de celle qui contient 100ng et que nous avons mis 2µl d’échantillon dans le puit .
100ng/2µl = 50 ng
Quel est l’objectif scientifique des manipulations du chapitre 5 : Ligation d’ADN et transformation bactérienne.
Procéder à la ligation des fragments d’ADN digérés et purifiés de GFP et de pUC19, puis à la transformation des bactéries super-conmpétentes DH5a avec le produit de la ligation gfp+pUC19.
Quelle est l’enzyme la plus utilisée pour obtenir des molécules d’ADN recombinantes ?
Ligase du bactériophage T4
La ligase T4 a besoin de quoi pou travailler efficacement ?
- ATP
- Mg2+
À quoi sert le Mg2+ dans le travail de la ligase T4 ?
favoriser l’extension des groupements phosphates de l’ATP
Quelle est la formule afin de déterminer la quantité d’insert à utiliser dans le mélange de ligation ?
qté d’insert (ng) = ( qté vecteur (ng) x taille insert (Kb)/ taille insert (Kb) ) x ratio molaire insert/vecteur.
Quel est le ratio molaire (vecteur : insert) ?
1:3
Calcul : Vous liguez l’ADNc de la GFP (770pb) dans 50 ng de pUC19 (2676 pb). Quelle quantité de GFP est nécessaire en ng ?
43 ng d’insert GFP (voir diapo examen final 20) Donc, on a 50 ng qui vont s’associer dans 43/3 ~ 15ng de GFP. Car 50 ng dans 43 ng ce n’est pas le bon ratio.
Pour une ligation réussi, il doit y avoir plus de vecteurs que d’insert ?
Non, plus d’insert pour favoriser les chances qu’il se lie avec le vecteur.
Le ratio 1 : 3 est utilisé pour les inserts plus petits que … ?
800 pb, donc ça marche avec l’insert GFP car il est de 770 pb.
Si on utilise un insert plus grand que 800 pb ou que le vecteur n’a pas été phosphorylé avant la ligation ou que les deux extremités de l’insert sont à bouts francs. Quel ratio molaire il faudrait utiliser ?
1 : 6
Compléter le tableau sur le produit de la ligation.
Diapo examen final 21 ou page 45 cahier
Compléter le tableau sur le nb de transformants avec le produit de ligation pUC19 + GFP.
Diapo examen final 22 ou page 47 cahier
Quel est l’objectif scientifique du chapitre 6: Induction de l’expression de protéines recombinantes ?
Vérifier la capacité d’induction de l’expression de la protéine GFP recombinante à partir du nouvel ADN recombinant pUC19/GFP.
La souche de bactérie E. coli DH5a est caractérisée par une surexpression constitutive de quoi ?
Protéine lacI
Quel est le rôle de la protéine lacI ?
Répresseur (régulateur allostérique négatif) de l’expression des séquences codantes situées en aval du promoteur Lac
Que se passe-t-il au niveau du promoteur des bactéries, quand il y a administration de l’IPTG ?
IPTG va se lier au répresseur (LacI) et va changer sa conformation.
Donc, LacI va être inactivé et ne pourra plus se lier à l’opérateur (O) = Promoteur lac n’est pas bloqué.
ARN pol n’est pas bloqué et va induire l’expression des gènes en aval (LacZ, LacY, LacA)
Quelles sont les conditions d’induction pour un bon rendement? (3)
- Temps alloué pour l’expression
- Concentration de l’IPTG
- Taux d’aération
Dans ce labo, quelles sont les conditions d’inductions ?
- Induction à un temps
- Concentration d’IPTG
Compléter les calculs pour la préparation du tampon de lyse/chargement.
Diapo examen final 24 ou page 52 cahier
Quel est l’objectif scientifique du chapitre 7 : Immunobuvardage de type Western Blot ?
Mesurer la production de la protéine recombinante GFP, parmi les protéines totales des bactéries transformées et induites.
La migration par électrophorèse dépend de quoi ?
- Friction dans le milieu
- Densité de charge de la molécule
Quelle est la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée ?
SDS-PAGE
Qu’est-ce que le SDS ?
Un détergent anionique dont le groupement sulfate possède une charge négative.
Quels sont les rôles du SDS ?
Dénature les protéines sans briser ni les liens peptidiques ni les ponts disulfures et leur confère une charge semblable = charge négative. Ce qui signifie qu’elles vont toutes migrer vers le pôle + en fonction de leur masse lorsqu’elles seront placées dans un champ électrique.
À quoi sert l’agent réducteur mercaptoéthanol ?
Réduire les ponts disulfures de résidus de cystéine de protéine pour libérer les groupes sulfhydrile.
Qu’est-ce que le PAGE (gel polyacrylamide) ?
Un support gélatineux finement réticulé
Comment est fabriqué le gel de polyacrylamide (PAGE) ?
En mélangeant:
1. Acrylamide (donne des chaînes linéaires)
2. Bis-Acrylamide (donne des chaînes ramifiées)
Que permet le mélange Acrylamde + Bis-acrylamide dans le PAGE ?
Un réseau, dont les mailles sont de taille variable. Comme un tamis moléculaire
Quel est le gel utilisé pour la séparation des protéines par SDS-PAGE ?
Un gel discontinue en concentration de polyacrylamide différente
Quelles sont les 2 parties du gel discontinue ?
Haut : Gel de compression à 5% en acrylamide et pH 6.8
Bas : Gel de résolution de 5%-20% en acrylamide et pH de 8.8
Que permet la coloration par bleu de Coomassie ?
Suivre la migration et visualiser les protéines
Qu’est-ce que l’acrylamide ?
Monomère formant le polymère appelé polyacrylamide. Sa concentration détermine la gamme de taille résolue par un gel quelconque
Qu’est-ce que le Bis-acrylamide ?
Comme l’acrylamide, mais peut relier 2 chaînes voisines en s’y intégrant. Il est un agent réticulent qui va avoir un impact sur le pouvoir de séparation du gel.
Qu’est-ce que le TEMED ?
Catalyseur
Qu’est-ce que le persulfate d’ammonium ?
Catalyseur et avec le TEMED, il favorise la formation de radicaux (SO4-) qui accèlerent la polymérisation du polyacrylamide.
Les protéines 10-20 kDa seront séparées à quoi ?
à plus de 15% d’acrylamide
Les grosses protéines de plus de 10kDa seront séparées à quoi ?
à 5-10 % d’acrylamide
Qu’est-ce que la glycine ?
Anion qui transporte le courant électrique
Est-ce que l’APS et le TEMED doivent être manipuler sous la hotte ?
Oui
À quoi sert la glycine et le chlorure dans le gel de compression ?
Créer un front de migration net et compressée
Quel est le rôle du chlorure ?
Ion rapide qui forme le front de migration (tire les molécules)
Quel est le rôle de la glycine
Ion lent qui créé une zone de concentration en repoussant les analystes (pousse les molécules)
Qu’est-ce qui se passe dans le gel de compression avec la glycine et le chlorure ?
- Le chlorure, en tant qu’ion mobile et petit, avance rapidement dans le gel sous champ électrique.
- La glycine (sous forme zwitterionique à pH neutre) migre beaucoup plus lentement.
- Entre les deux, les molécules d’ADN ou de protéines sont compressées dans une fine zone, car elles sont « coincées » entre l’ion rapide (Cl⁻) et l’ion lent (glycine).
- Ce stacking améliore la résolution, surtout au début de la migration.
Pour mieux détecter les protéines d’intérêt, il faut procéder à un transfert sur une matrice, laquelle ?
Membrane de nitrocellulose
Quel est le principe de la membrane de nitrocellulose ?
Lier les protéines de façon hydrophobe et électrostatique, car après la séparation les protéines sont toujours entourées de SDS (charge - )
Après le transfert des protéines sur la membrane de nitrocellulose, il faut procéder à quoi ?
Un blocage de tous les sites de fixation potentiels de l’Ac utilisé pour la détection immunologique
Pourquoi l’étape de blocage est très importante ?
Assurer la spécificité de la technique
Que se passe-t-il si il n’y a pas de blocages de réalisée après le transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose ?
L’analyse par image décèlerait une détection des bandes supplémentaires non spécifiques
Comment sont liées les Ac ?
Par leur région Fc, à un enzyme (AP ou HRP)
Qu’est-ce que les enzymes rapporteurs (AP ou HRP) produisent ?
Des signaux par réaction avec des substrats pour provoquer des changements de couleur ou des changements d’émission d’une lumière.
Comment se fait le sandwich pour le transfert dans la membrane de nitrocellulose ?
Vers anode (+)
1. Papier imbibés de tampon
2. Membrane
3. Gel d’agarose
4. Papier imbibés de tampon
Vers cathode (-)
Comment se fait l’analyse semi-quantitative du signal ?
Les changements de couleur ou des changements d’émission d’une lumière peuvent être quantifiés par densitométrie.
Qu’est-ce que la densitométrie ?
Une technique utilisée pour mesurer la densité d’un groupe de protéines en utilisant un logiciel d’analyse d’image pour calculer la densité de chaque bande.
Plus la migration est lente, … ?
Meilleure la résolution sera
page 63
cahier de lab
Nommer un ingrédient actif du tampon de solubilisation QG et expliquer le rôle de celui-ci.
Thiocyanate de guanidinium
Rôle: Solubilise l’agarose pour libérer l’ADN
Nommer un ingrédient actif du tampon d’élution EB et expliquer le rôle de l’ingrédient.
Tris-Cl (souvent à pH 8.5)
Rôle : Maintient un pH optimal (légèrement basique) pour la stabilité de l’ADN
Si après pesée de votre morceau d’agarose contenant votre ADN GFP digéré, la balance indique 200 mg : à l’étape 4 du protocole, quel volume d’isopropanol allez-vous ajouter ?
200 µL d’isopropanol
Comment est choisi le tampon de ligase 10X qui sera utilisé?
Le tampon de ligase 10X est fourni avec la ligase d’ADN (souvent T4 DNA ligase)
Est-ce que les bactéries utilisées pour la transformation avec le produit de ligation sont identiques à celles qui avaient été utilisées au chapitre 1 pour la transformation avec des vecteurs plasmidiques (avec ou sans insert?)?
Oui
Dans le tampon de lyse/chargement de protéines, quelles sont les 6 composantes?
- Tris-HCl
- SDS
- 2-mercaptoéthanol
- Glycérol
- Bleu de bromophénol
- Eau déionisée
Quand on prépare le mélange des gels qui formera les gels de résolution et de compaction, pourquoi attend-on d’être prêts à couler le gel avant d’ajouter l’APS et le TEMED?
Parce que l’APS et le TEMED sont les agents initiateurs de la polymérisation de l’acrylamide, ce qui transforme le liquide en un gel solide.
Et pourquoi dépose-t-on TEMED et APS à des endroits différents du tube au moment de les ajouter (sous la hotte) ?
Très volatils et permet un environnement sécuritaire
La membrane de nitrocelluse est chargé … ?
Négativement
Pourquoi le méthanol (contenu dans la solution de transfert) est important ?
Pour enlever le SDS des protéines ey augmenter leur affinité pour la membrane de PVDF
Est-ce que le méthanol réduit l’efficacité de l’élution ?
Oui en diminuant la taille des pores
Qu’est-ce que permet la coloration de Rouge de Ponceau ?
Permet de colorer les protéines et permet de voir si l’électrophorèse et le transfert ont bien fonctionné
V ou F : La coloration de Rouge de Ponceau est spécifique à la protéine recherchée.
Faux
Que se passe-t-il si le blocage de la membrane n’a pas été bien réalisé ?
La fixation des Ac primaire sur la membrane donnerait un bruit de fond élevé et il y aurait des bandes supplémentaires lors de la détection.
Quelle solution de blocage avons-nous utilisé ?
Lait en poudre
Quel est l’Ac secondaire utilisée pour détecter la GFP et la GAPDH
Ac anti-souris
Qu’est-ce que détecte l’Ac anti-souris ?
Il détecte la portion Fc des deux Ac primaires
À quoi sert la GAPDH ?
Contrôle de normalisation, elle est utilisé comme protéine de référence. En effet, elle est constamment exprimée dans plusieurs types cellulaires
Pourquoi le gel de compression contient moins d’acrylamide que le gel de résolution ?
Le gel de compression a moins d’acrylamide pour faciliter la concentration des échantillons,
tandis que le gel de résolution a plus d’acrylamide pour assurer une bonne séparation des protéines selon leur taille.
Expliquer les résultats de la révélation de GFP et GAPDH.
Diapo examen final 28 ou page 70 cahier
