Labo 1-2-3 Flashcards
Quel est l’objectif scientifique du chapitre 1 : Transformation bactérienne ?
Procéder à la transformation de bactéries hôtes E. coli DH5a avec les ADN plasmidiques à amplifier en vue du sous-clonage
Quelle est l’approche méthodologie du chapitre 1 : Transformation bactérienne ?
Le choc thermique
Quels sont les 3 processus de transfert génétique chez les bactéries ?
- Transformation
- Transduction
- Conjuguaison
V ou F : Le mécanisme de transfert génétique chez les bactéries est en collaboration avec le phénomène des mutations.
Vrai
Que permettent les mécanismes de transfert génétique chez les bactéries ?
- Diversité génétique (évolution)
- Émergence de nouvelles espèces bactériennes
Comment est transmis l’information génétique dans les mécanismes de transfert globalement ?
La souche donatrice est acquise par une autre cellule, la souche réceptrice.
Qu’est-ce que la transformation ?
Un processus de transfert génétique où l’ADN provenant d’une bactérie donatrice est englobé par la cellule réceptrice.
Comment est l’ADN provenant d’une bactérie donatrice avant d’être incorporé par la bactérie réceptrice ?
ADN est libre dans le milieu avant d’être incorporé par la bactérie réceptrice
Comment est désignée la souche réceptrice exprimant un trait génétique du nouvel ADN ?
Cellule transformée
Qu’est-ce que la compétence ?
Capacité d’une bactérie à incorporer l’ADN étranger du milieu environnant dans son milieu intracellulaire.
Est-ce que la souche E.coli DH5a est compétente ?
Oui, car elle permet une transformation à haut rendement (1 à 3 x 10^9 colonies/µg d’ADN)
Quelles sont les conditions physico-chimqiues de l’induction de la compétence ?
- Stade de croissance des cellules réceptrices.
- Valeur nutritive du milieu de culture.
- Degrés d’aérobiose/anaérobiose.
- pH
- Présence d’une [ ] appropriée de cations divalents
Pourquoi on dit que le choc thermique est aussi une méthode chimique ?
Car elle implique l’incubation bactérienne en présence d’un composé chimique (CaCl2), mais comporte néanmoins un paramètre physique : celui du changement rapide de la température.
Quelle est une autre approche méthodologique pour la transformation, mais purement physique ?
Électroporation
Qu’est-ce que la méthode d’électroporation ?
Imposition d’un brève courant électrique aux bactéries, modifiant les propriétés électriques de leur paroi et y permettant la création de pores.
Quel est l’avantage et le désavantage de l’électroporation comparé à la méthode du choc thermique ?
A: entrée d’un grand plasmide
D: Entraine davantage de perte de viabilité des bactéries
Quel est le matériel de départ du chapitre 1 : transformation bactérienne ?
Construction pBS/GFP
Pourquoi avons-nous choisi le vecteur pUC19 pour recevoir le gène gfp ?
- Relation avec les étapes de sélection et de criblage des transformants
- Stratégie de sous-clonage moléculaire unidirectionnel du gène gfp
À quoi sert un marqueur de sélection ?
Savoir quelles cellules bactériennes ont incorporé une copie du vecteur de clonage (plasmide)
Quel est le marqueur de sélection le plus utilisé ?
Gène de résistance aux antibiotiques (Ex: AmpR)
Quel est le rôle du marqueur de criblage ?
Permet de déterminer quelle bactéries possède la construction dans la bon sens. En effet, toutes les bactéries poussent mais la couleur de certaines colonies vont différer.
Lors du criblage, qu’indiquent des colonies bleus ?
Plasmide conduit à l’expression du peptide a, et qu’il ne porte pas d’insert (GFP).
Lors du criblage, qu’indiquent des colonies blanches ?
L’insert (GFP) est présent
Le système de criblage se fait par quel système ?
Complémentation de la ß-galactosidase
Le choc thermique s’effectue à quelle température et combien de temps ?
42°C pendant 30 sec
Pourquoi le milieu SOC est-il mieux adapté que le milieu LB, pour l’étape d’incubation des bactéries pendant 30-45 minutes après le choc thermique
Le milieu SOC est préférable au milieu LB pour l’incubation des bactéries après un choc thermique, car il fournit des conditions optimales favorisant la récupération cellulaire et l’expression initiale de l’ADN exogène. Sa composition, nettement plus riche en nutriments spécifiques, notamment en glucose et en ions magnésium, offre un environnement favorable à la régénération des bactéries. À la suite d’un choc thermique, les cellules bactériennes sont particulièrement stressées et fragilisées. Le milieu SOC contribue à la restauration rapide des membranes cellulaires endommagées, facilite l’entrée des bactéries dans une phase de croissance active grâce à la disponibilité accrue des nutriments, et améliore la viabilité globale des cellules. Ces propriétés se traduisent par un rendement de transformation significativement accru par rapport au milieu LB.
Quel est l’objectif scientifique du chapitre 2 : Préparation d’ADN plasmidique ?
Isoler l’ADN plasmidique des deux populations de bactéries transformées.
Quelle est l’approche méthodologique du chapitre 2 : Préparation d’ADN plasmidique ?
La minipréparation d’ADN plasmidique
Qu’est-ce qu’un plasmide ?
Des éléments extra-chromosomiques ayant leur propre origine de réplication et donc capable de se reproduire de façon autonome.
La réplication des plasmides est assurée par quoi ?
La machinerie de la bactérie hôte.
V ou F : Les plasmides peuvent être transmis d’une bactérie à l’autre indépendemment du chromosome bactérien.
Vrai
Comment est l’ADN du plasmide ?
Circulaire double brin
Est-ce que les plasmides existent sous forme linéaire dans la bactérie ?
Rarement
Pour quoi les plasmides sont utilisées dans le domaine scientifique ?
En ADN recombinant, afin de produire une protéine d’intérêt ou encore pour amplifier un fragment d’ADN donné.
Que signifie le terme « préparation d’ADN » ?
Extraire l’ADN plasmidique d’une population de bactéries
Quelle est la différence entre les différents variants de la préparation d’ADN ?
La quantité d’ADN plasmidique de départ qu’on extrait pour l’expérience.
Que contient la S1 de la miniprep ( Tampon de resuspension) ?
- RNAse
Que contient la S2 de la miniprep (tampon de lyse alcaline) ?
- SDS
- Hydroxyde de sodium (NaOH)
Que contient la S3 de la miniprep (tampon de neutralisation ) ?
- Acétate d’ammonium
- Chlorhydrate de guanidine
Quel est le rôle du réactif RNAse dans la miniprep ?
La dégradation d’ARN de petite taille, car ils nuisent à l’analyse des plasmides
Quel est le rôle du réactif SDS dans la miniprep ?
Solubiliser les phospholipides et les protéines de la membrane cellulaire
Quel est le rôle du réactif NaOH dans la miniprep ?
- Augmenter le pH et permet de dénaturer l’ADN chromosomal
- Lyser les bactéries
Quel est le rôle du réactif acétate d’ammonium dans la miniprep ?
Provoquer la précipitation des composants cellulaires (membranes, protéines, ADN génomique)
Quel est le rôle du réactif chlorhydrate de guanidine dans la miniprep ?
- Isoler l’ARN grâce à sa capacité d’inhiber les RNases
- Dénaturer les protéines
- Faciliter la liaison de l’ADN plasmidique au support en silice ou fibre de verre **
Quel est le rôle du réactif silice ou fibre de verre dans la miniprep ?
Lier sélectivement l’ADN plasmidique
Quel est le rôle du réactif alcool (éthanol) dans la miniprep ?
Préparation du tampon de lavage de l’ADN retenu par absorption sur la colonne de silice
Quelles sont les étapes de la procédure de miniprep plasmidique en 3 étapes ?
- Lyse alcaline des bactéries et élimination des débris cellulaires
- Absorption de l’ADN sur la colonne de silice
- Lavage et élution de l’ADN (purifié et concentré)
Lors d’une centrifugation, la charnière doit être placé où afin qu’on puisse bien localisé le culot ?
Vers l’extérieur
Pourquoi est-il important de désinfecter la micropipette après chaque utilisation lors de la préparation d’ADN plasmidique ?
Afin d’éviter la contamination
Pourquoi manipuler avec les gants la guanidine ?
Parce que la guanidine est toxique
Quel est le rôle du Buffer PB dans la miniprep ?
- Éliminer les contaminants (sels, protéines, ARN)
- Préparer la colonne pour le lavage final
- Assurer une liaison optimale de l’ADN avec la membrane de silice
Quel est le rôle du Buffer PE (solution de lavage SL)
Éliminer les impuretés (détergents, sels, protéines)
Pourquoi la colonne doit être bien sèche avant de procéder à l’élution ?
Car si l’éthanol (Buffer PE) reste dans la colonne, il va se mélanger avec le Buffer PE (solution SE d’élution) = ADN va être moins concentré.
Pourquoi on doit mettre les éléments au centre de chaque colonne sans toucher à la silice ?
- Protéger la membrane de silice
- Assurer une répartition homogène du liquide
- Limiter les contaminations croisées
Quel est le rôle de chacune des solutions 1, 2 et 3 ?
S1 (Tampon de resuspension) : Préparer les cellules pour la lyse en les resuspendant de manière homgène et en initiant la dégradation de l’ARN.
S2 (Tampon de lyse alcaline) : Lyser les cellules en brisant les membranes et en dénaturant les macromolécules.
S3 (Tampon de neutralisation) : Neutraliser la solution pour précipiter les débris cellulaires et l’ADN génomique, tout en permettant la renaturation du plasmide.
Pourquoi avant de procéder à la lyse alcaline des bactéries, on doit s’assurer que la culture bactérienne donne une valeur de densité optique (DO) à 600 nm située entre 1,0 et 2,5 ?
La DO à 600nm mesure la turbidité de la culture
bactérienne, qui est proportionnelle à la concentration en bactéries. Cette valeur est critique pour la miniprep d’ADN plasmidique, car elle influence l’efficacité de la lyse et la récupération du plasmide.
Pourquoi les densités optiques suivantes sont-elles inadéquates pour atteindre les objectifs de la minipréparation d’ADN : a) inférieure à 1,0; b) supérieure à 2,5 ?
DO < 1,0 : Culture trop diluée = Faible rendement en ADN plasmidique.
La culture contient trop peu de bactéries, ce qui signifie qu’il y aura moins d’ADN plasmidique disponible pour l’extraction. Une culture trop diluée, peut conduire aussi à une lyse inefficace, car les quantités de
réactids sont optimisées pour une charge bactérienne plus élevée.
DO > 2,5 : Culture trop concentrée = Lyse inefficace et contamination .
La culture est trop dense, ce qui peut entraîner une lyse incomplète pusique les réactifs ne pénètrent pas efficacement dans toutes les cellules. Cela peut aussi provoquer une libération excessive d’ADN génomique et de contaminants (protéines, lipides, ARN), compromettant la pureté du plasmide.
Quel est l’objectif spécifique du chapitre 3 : Digestion enzymatique ?
Digestion enzymatique des deux échantillons d’ADN plasmidiques extraits et de récupérer sur gel les fragments digérés nécessaires au sous-clonage.
Quelle est la méthode utilisée pour la recombinaison artificielle de l’ADN ?
Recombinaison par transposition
Qu’est-ce que la recombinaison par transposition implique ?
Cela implique l’utilisation d’enzymes d’origine bactérienne spécialisés appelées enzymes de restriction.
Quel est le rôle des enzymes de restriction 6
Restreindre l’ADN étranger, en le découpant.
Comment sont appelés les cibles des enzymes de restriction ?
Sites de restriction
Quelle stratégie de sous-clonage a été utilisée ?
Unidirectionnel, afin que l’insertion du gène gfp soit orientée de façon à respecter le sens de transcription du gène à partir du promoteur LacZ dans le vecteur pUC19.
Quels sont les 2 enzymes de restriction utilisés pour la digestion enzymatique ?
- PstI (Site CTGCAG avant site d’EcoRI en N-term)
- SalI (Site GTCGAC après site d’EcoRI en C-term)
V ou F : Afin de respecter la stratégie unidirectionnelle et de respecter le sens de la transcription du gène, qu’est-ce qu’il faut utiliser comme ER ?
Digérer les vecteurs pBS/GFP et pUC19 avec les mêmes ER (PstI ET SalI)
Pourquoi on fait migrer l’ADN du pôle négatif vers le pôle positif ?
Car l’ADN comporte des liaisons phosphodiesters chargées négativement à pH neutre
Que permet la matrice d’agarose ?
De séparer les molécules d’ADN selon leur taille
Où se trouve les plus grands fragments d’ADN sur le gel d’agarose ?
Vers le haut, car ils migrent plus lentement
Où se trouve les plus petits fragments d’ADN sur le gel d’agarose ?
Vers le bas, car ils migrent plus rapidement
Comment l’ADN migre selon leurs différentes formes topologiques ?
ADN circulaire superenroulé migre plus rapidement que l’ADN circulaire relâchée. L’ADN linéaire migre plus ou moins rapidement que l’ADN circulaire relâchée.
Qu’est-ce que le nicking ?
Bris du lien phosphodiester sur seulement 1 des deux brins = ADN linéaire
Comment l’ADN double brin est visualisé ?
Par intercalation du colorant fluorescent de bromure d’éthidium entre ses bases
V ou F : Le colorant bromure d’éthidium devient fluorescent lorsqu’il est éclairé par un rayonnement UV.
Vrai
Quel est l’alternative du colorant bromure d’éthidium ?
Colorant pour gel SYBR Safe
Est-ce que le colorant pour gel SYBR Safe est plus sensible que le colorant bromure d’éthidium ?
Oui, 2 fois plus sensible
Comment le SYBR Safe fonctionne ?
Se lie à l’ADN sans en changer la structure
Est-ce que le SYBR Safe a un potentiel mutagène plus faible que le bromure d’éthidium ?
Oui, car il se lie à l’ADN sans changer sa structure. Tandis que le bromure d’éthidium s’intercale entre les bases.
Pourquoi il faut mettre des gants avec les SYBR Safe ?
Pour éviter les contaminations de surface de travail
Est-ce qu’il faut mettre 2 marqueurs différents dans l’électrophorèse ?
Oui, car on a 2 types d’ADN (linéaire et circulaire)
Pourquoi il faut conserver les microtubes contenant les enzymes sur glace ?
Afin d’éviter une perte d’activité
Pourquoi il ne faut jamais tenir un microtube content une enzyme au niveau du liquide ?
Car ça va le réchauffer et causer une perte d’activité
Pourquoi lors du découpage de la bande d’agarose contenant les fragments digérés, il ne faut pas excéder 400 mg de quantité d’agarose ?
Car on excèderait la capacité de la silice
Dans le mélange réactionnel des digestions enzymatiques, pourquoi a-t-on choisi le tampon CutSmart 10X?
- Compatible avec plusieurs ER
- Présence de sérum d’albumine de bovine : stabilise et améliore l’activité des enzymes
Quel est le rôle du tampon Cutsmart 10X ?
Optimiser l’activité des enzymes de restriction en maintenant des conditions physico-chimiques stables pour la digestion enzymatique de l’ADN
Quels sont les ingrédients du tampon 10X ?
- Agent tamponnant : Tris-HCl
- Sels et ions : NaCl ou KCl, Mg2+
- Protéines stabilisatrices
Le Tampon de chargement (TCD) 5X possède trois ingrédients, lesquels ?
- Bleu de bromophénol : repère du front de migration
- Glycérol: augmenter la densité de la solution d’ADN pour que la solution tombe au fond du puits lors du chargement
- EDTA :Maintient un pH stable et protège l’ADN contre la dégradation.
Que contient le Tampon TBE 1X ?
- Tris base
- Acide borique
- EDTA
On utilise le tampon TBE1X pour quelle manipulation ?
Électrophorèse
Quelle est la taille du gène GFP ?
770pb
Dans le vecteur pBluescript, quelle est la distance entre SalI et PstI dans SCM ?
36 pb
Dans le vecteur pUC19, quelle est la distance entre SalI et PstI dans SCM ?
10 pb
Expliquer l’interprétation de la migration électrophorèse sur gel d’agarose sur la digestion de pBS/GFP et pUC19.
Diapo examen final 15
