Lab 3er parcial Flashcards
____ es la inserción de ADN nuevo, por ejemplo, un plásmido, en una célula u organismo. Esta puede ser natural o inducida. Da lugar a la recombinación genética
La transformación celular
Ej. maíz transgénico, soya, frutas transgénicas.
Todavía es un tema controversial
Aplicaciones en organismos eucariontes de la transformación celular:
Se le conoce como transfección
En celulas eucariones
es el proceso mediante el cual los elementos genéticos contenidos en el genóma de diferentes individuos se combina
Transferencia de genes entre bacterias
Esto permite que el individuo origine alguna nueva función que pueda dar como resultado____
una adaptación a los cambios en el medio ambiente
Originalmente las bacterias utilizan esta estrategia como adaptacion
PARA ADQUIRIR LA CAPACIDAD PARA ADAPTARSE A AMBIENTES CON ANTIBIOTICOS, o grandes contenido de sales, agua, etc. Esto les ha permitido colonizar varios espacio.
Los biologos moleculares empezaron a observar y a utilizar estos mecanismos para realizar la tecnologia del _____ para producir proteínas o productos que benefician a los seres humanos.
ADN recombinante
Utilizamos un kit: que contiene una acción didactica de la recombinación del ADN
Nos dan un plásmido (pGLO) y éste ya contiene un ADN que nos interesa producir. este ADN es un gen de una proteína (GFP) que se utiliza en medusas. entonces cuando está en oscuridad, emite florecencia gracias a ésta proteína.
Este gen se insertó en el plásmido pGLO.
Éste mismo kit contiene una muestra de E coli, entonces realizamos el procedimiento que implica que el e coli reciba el plásmido pGLO que ya trae la proteína GFP. una vez esto la e coli crece, se multiplica y empieza a expresar GFP y brillan. La tecnología utiliza un vector que le permite recibir un ADN extraño utilizando ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Transformación de E. coli en el laboratorio
- plasmido (pGLO) que ya contiene un ADN
- se agrega: GFP, proteína que permite la florecencia.
- El kit contiene una E. coli, entonces, se realiza el procedimiento para que la E. coli acepte el plasmido pGLO mediante un vector utilizando enzimas de restricción
- una vez esto la bacteria crece y se multiplica, si acepto el plásmido entonces, GRACIAS A LA PROTEÍNA DENTRO DEL PLASMIDO BRILLA
detonó el desarrollo de la ingenieria genética. 10 años más tarde en un sistema recombinante realizaron la producción de la insulina.
Realizaron una Enzima para que les permitiera cortar el plásmido y entonces pusieron en contacto al plasmido abierto con el gen del ARN ribosomal de una rana.
Se va a pegar el llamado inserto en el vector, este inserto contiene el gen de interes.
en 1992-1993
Se refiere a la técnica que permite la introducción de un DNA extraño en un organismo y consigue que se exprese como si fuera propio
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Preparación del inserto: Digestión del ADN de interés en posiciones precisas con endonucleasas de restricción
PASO 1 de la transformación de bacterias
se tiene que conocer la secuencia de interés. seleccionas las enzimas de restricción para cortar el segmento (dentro de la secuencia debe estar el gen de interés)
Seleccionar el vector de clonación (pequeña molécula de ADN capaz de autoreplicarse)
PASO 2 de la transformación de bacterias
poner nuestro ADN recortado en un vector de clonación, debe tener un sitio de restricción, se corta y se generan los extremos pegajosos
Insertar los fragmentos de interés en el vector de clonación (en presencia de ADN ligasa)
Las moléculas de ADN que están compuestas de materiales genético de diferentes fuentes se denominan ADNs recombinantes
PASO 3 de la transformación de bacterias
pongo en contacto los fragmentos de interés con el vector abierto y pongo una ligasa (VECTOR RECOMBINANTE)
Preparar células competentes para que reciban el vector recombinantes
PASO 4 de la transformación de bacterias
preparar a la e coli (hacerla competente: generar en su membrana y su pared celular la formación de poros, para que por medio de esos poros el vector pueda entrar)
Transformación: insertar los vectores de clonación a células específicas que contienen toda la maquinaria genética para la expresión de la información contenida en el vector
PASO 5 de la transformación de bacterias
Pongo el vector recombinante en contacto con la E coli y sucede la TRANSFORMACIÓN
Seleccionar o identificar a las células que contienen al ADN recombinante
PASO 6 de la transformación de bacterias
Consentir a la e coli para que crezca y se multiplique, y al hacer esto, expresar lo que el vector contenía
en laboratorio sólo se hacen los pasos:
4
5
6
molecula de adn capaz de recibir otro adn exógeno
vector
origen de la replicación para que cuando la e coli se duplique también duplique la info de interés
ori
codifica para la beta lactamasa reconoce el anillo de lactama (es una estructura que comparten varios antiboticos) el cual rompe al antibiotico y ya no va a inhibir el crecimiento de la bacteria. Entonces decimos que es un GEN REPORTERO porque nos reporta cuando la bacteria recibió al plásmido, porque si le pongo ampicilina LA BACTERIA va a crecer entonces quiere decir que ya recibió el plásmido
gen bla
b-lactamasa-resistencia a la ampicilina
gen que nos interesa, proteína verde florecente
GFP
es un gen regulador de la expresión
(si no le pongo este gen la bacteria no brilla, es un gen que nos permite identificar si el inserto que le puse al vector es el inserto correcto)
araC- regulador de arabinosa
REGULA LA EXPRESIÓN DE GFP
sirve para que inicie su proceso de replicación
promotor
estos dos en conjunto hacen un swich de encendido
araC y promotor
Consiste en preparar a la célula huesped para que reciba el inserto
Preparació de células competentes
preparar a la e coli para que reciba el vector, hacerla COMPETENTE
incubación con solución hipotónica de CaCl, se piensa que se forma un gradiente eléctrico que facilita la formación de poros
transformación quimica
es decir ponemos a la bacteria en una solucion hipotonica de cloruro de calcio y le producimos un choque térmico, y eso lo pones cuando la bacteria esta incubando a 3 grados centrigrados, y comienza a formar una despolarización en la membrana y pared por el cambio de temperatura.
esto dura 50 s.
Se aplican pulsos eléctricos para generar poros
Electroporación
literalmente darle toques a la bacteria y con eso se abren los poros y entonces puede entrar el vector
se debe consentir a la bacteria ______ para que los poros se cierren, recupere su integridad y empiece a crecer. Despues la sembramos en un medio de cultivo que le guste para que produzca lo que queremos.
Despues de utilizar algún medio de preparación competente
Depende del tipo de marcador del vector
Resistencia a antibioticos
Producción o no de moleculas fluorecentes
Producción de enzimas que dan un color con cierto sustrato
Identificación de colonias transformadas
Lo vamos a saber mediante los genes reporteros y si agregamos araC
cuando las bacterias estan en el medio de crecimiento y le pones ej. ampicilina el antibiótico INHIBE el crecimiento de las bacterias que no fueron transformadas
¿cuales colonias recibieron al vector y cuales no las recibieron?
- preparar 2 tubos ependor de 1ml a esos tubos les agregamos medio mililitro de medio de cultivo LB (medio en donde crece e coli)
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 1
- los etiquetamos a uno con el signo más pues es este en el que vamos a agregar el plasmido. a otro el signo negativo en donde NO agregaremos plasmido. Esto es para LLEVAR UN CONTROL NEGATIVO, para saber que está funcionando.
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 2
- añadirle 250 microlitros de cloruro de calcio, que va a favorecer que la celula se vuelva COMPETENTE y lo ponemos en hielo
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 3
- inoculamos e coli (usamos un area esteril, pones un mechero y al rededor de las llamas se genera un espacio con menor probabilidad de que haya bacterias en el medio)
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 4
- les ponemos a la bacteria el plásmido (a las del tubo positivo)
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 5
- cerramos y llevamos el tubo en baño maría para el choque térmico y ENTRA EL VECTOR =TRANSFORMACIÓN DE LA BACTERIA=
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 6
- dejamos que se enfrie
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 7
- ponemos medio de cultivo para que se diluya el cloruro de calcio
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 8
- sembrar nuestras muestras en cajas petri, contienen el medio de cultivo en forma sólidA
PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN EN EL LABORATORIO PASO 9
se debe a que hay muchas bacterias creciendo
La opacidad
Producción de proteínas y hormonas: polimerasa; insulina; hormonas sexuales.
Generación de plantas transgénicas: plantas con resistencia a ambientes externos
Generación de animales transgénicos: ratones transgénicos que sobreexpresan la hormona del crecimiento
Producción de microorganismos transgénicos para bioremediación: microorganismos que comen hidrocarburo
Aplicaciones de tecnología del ADN recombinante
Plantas genéticamente modificadas: primeros organismos eucariontes re combinados. Brillan de color verde. - Plantas transgénicas como el maíz que son resistentes a plagas. -Animales transgénicos como el ratón que expresa la hormona de crecimiento, producción de prtoesinas transgénicas. - insulina fue el primero producto recomvibante que se produjo en grandes cantidades a principio de los años 80, se sigue produciendo usando bacterias o levaduras recombinantes (imulina). -Proteínas recombinantes: 130 medicamentos basados en proteínas recombinantes como la de hepatitis B, factores hematopoyeticos, interleucinas, etc. Se reproducen a nivel industrial.
Aplicaciones de tecnología del ADN recombinante
practica 5
Extracción y purificación de proteínas
______ son macromoléculas conformadas por cadenas de aminoácidos unidos por
enlaces polipeptídicos.
Las proteínas
Las proteínas participan en todos los procesos cruciales de las
células de los seres vivos desempeñando un número de funciones amplio: ____
participan en la
catálisis de las reacciones químicas celulares, el transporte de moléculas, la protección
celular, la regulación, la transducción de señales, algunas son estructurales e incluso se
encargan del movimiento.
la secuencia de aminoácidos en la cadena
una larga cadena de aa que se obtiene de la traducción, su longitud es variable, las propiedades dependen de el tipo de aa que contenga la proteína
unido por enlace peptidico amida
Estructura primaria
siempre está de lado derecho el carboxilo y del izquierdo el ____
amino
disposición espacial que es periódica en algunas zonas de
la cadena
conformaciones que se llevan a cabo por la interacción de los puentes de hidrógeno (pueden unirse con N, O, F)
pueden tener tanto giro a la derecha como a la izquierda
monomero de la colagena todos sus giros son levógiros
Estructura secundaria
la estructura determina la función, si la estructura se pierde____
se forma una proteína trunca, por tanto la función se altera
es la forma tridimensional que adquiere la cadena completa
Estructura terciaria
es el arreglo que adquieren las diferentes subunidades que
conforman a una proteína de más de una cadena polipeptídica.
Estructura cuaternaria
- repulsión o tracción electrostática entre residuos
- impedimeto estérico (entre residuos adyacentes y entre residuos separados por 3 o 4 aa)
- La prolina y la glicina tienen un efecto desestabilizador de la alfa hélice
Factores que afectan a la estabilidad de la helice alfa
la estructura de la proteína depende de los aa.
Los aa que más desestabilizan: prolina y glicina
es una nueva etapa de la investigación biológica, que incluye la
caracterización de la expresión de las proteínas codificadas por un genoma (PROTEOMA).
La proteómica
permite identificar, categorizar y clasificar a las proteínas con respecto a su
función y las interacciones que establecen entre ellas. De este modo se pueden caracterizar
las redes funcionales que establecen las proteínas y su dinámica durante procesos
fisiológicos y patológicos.
La proteómica
El proteoma de una célula varía según____
ASÍ MISMO:
refleja su estado
fisiológico y por lo tanto un estudio de su perfil proteico a lo largo del tiempo puede
ayudarnos a estudiar las adaptaciones fisiológicas que le han permitido adaptarse las
condiciones ambientales que lo rodean. De esta manera la proteomica tiene también
aplicaciones en el estudio de la evolución de las especies.
el estado en el que se encuentre la célula, si se
encuentra en una situación de estrés, bajo el efecto de diferentes fármacos o de una
hormona. Así, en cada momento y en cada tipo celular el perfil de proteínas expresadas
será diferente.
La proteómica de _______ se encarga del estudio de la abundancia relativa de las
proteínas y de sus modificaciones postranscripcionales
expresión
La proteómica _____ se encarga de la caracterización de la estructura
tridimensional de las proteínas
estructural
La proteómica ____ se encarga de la localización y distribución subcelular de
proteínas y de las interacciones que se producen entre las proteínas y otras
moléculas con el fin de determinar su función
funcional
a) Identificación de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades
b) Identificación de nuevos fármacos
c) Determinación de mecanismos moleculares involucrados en la patogenia de
enfermedades
d) Análisis de rutas de transducción de señales
Las aplicaciones de la proteómica
Las técnicas más usadas en proteómica se basan en la electroforesis y en la ________.
espectrometría
de masas
Técnicas empleadas para analizar globalmente el proteoma y separar sus proteínas.
Una de las técnicas más utilizadas es la electroforesis mono y bidimensional.
Tecnica 1 de proteómica
Técnicas usadas para analizar individualmente las proteínas. Con este objetivo se
utilizan distintos tipos de espectrometría de masas,
Tecnica 2 de proteómica
Técnicas que se usan para estudiar interacciones entre proteínas, las técnicas
utilizadas permiten averiguar con qué proteínas interacciona una proteína problema
o sonda, a partir de la expresión en fagos.
Tecnica 3 de proteómica
- Tipo de enlace que mantiene la estructura primaria de las proteínas
Covalente
- Es el conjunto de proteínas expresadas en un tejido o en una célula particular bajo condiciones de medioambiente y desarrollo específicas.
Proteoma
- La conformación nativa de una proteína bicatenaria equivale a su
- El peso molecular de las proteínas se mide en
Daltones
- Nivel estructural de las proteínas representado por plegamientos periódicos y repetitivos de segmentos de la cadena polipeptídica completa
Estructura secundaria
- Se añade al gel después de la electroforesis para hacer visibles las bandas de proteínas separadas
Azul de Coomassie
- Se utiliza en el laboratorio para formar el gel para la electroforesis de proteínas
Poliacrilamida
- La relación entre masa y distancia migrada en las proteínas es:
- El plásmido transformado que se utiliza en el laboratorio contiene un gen de las medusas que codifica para la proteína
GFP
- El plásmido que se utiliza para la transformación en el laboratorio:
pGLO
- La transformación celular es la inserción de___ utilizando por ejemplo un ___ en una célula u organismo
ADN, plásmido.
- Se añade a la muestra que se separa por electroforesis para hacerla más densa y que no se expanda fuera del pozo.
Glicerol
- En la SDS-PAGE 1D, la separación de las proteínas está determinada por
el tamaño de la molécula
- Es uno de los métodos más utilizados molecular para inducir la competencia en bacterias es:
Electroporación
- Se utiliza en la electroforesis 1D para dar carga negativa a las proteínas
SDS
- Tipo de fuerza que mantiene la estructura secundaria de las proteínas
iónico**
- En la electroforesis 2D la última separación de las proteínas está determinada por:
El punto isoeléctrico
EXAMEN TEORÍA
1. Proceso que requiere energía para la transferencia de los aminoácidos al RNAt correspondiente:
Activación
- Las tetraciclinas actúan bloqueando el sitio A
Verdadero**
- Proteínas que ayudan a la unión del RNA, con la subunidad inicie la síntesis de proteínas.
Sec**
- Secuencia que contiene al codón de inicio en eucariontes
KOZAK
- En las mutaciones puntuales por transición ocurre la sustitución de una base nitrogenada por otra del mismo tipo:
Verdadero.
- Enzima del nucleosoma que sintetiza las moléculas de ARNhn y ARNsn.
ARN pol II.
- Regulación de la transcripción que implica un cambio en la estructura del RNA naciente que impide el avance de la RNApol.
Atenuación de la transcripción.
- Macroproteína que ofrece un ambiente adecuado a la proteína naciente para que se pliegue de manera correcta.
Chaperona
- Brazo del RNAt que reconoce a la aminoacil-ARNt sintetasa
Bucle D
- Brazo del RNAt que reconoce al RNAm
Bucle anticodón
- Cuando uno de los cromosomas pierde uno de sus brazos se conoce como haploidía.
Verdadero.
- Se requiere de estos dos elementos para que ocurra la traslocación o avance del ribosoma durante la elongación.
eFE-G y GTP
- ARNsn que forman parte del ayustosoma y se encargan de flanquear las regiones codificantes para realizar el splicing
U1 y U2.
- Regulación de la transcripción que es predominante e implica diferentes factores como promotores:
Transcripcional***
- Codón de paro.
UAG
- Regulación de la transcripción que implica un cambio en la estructura del nucleosoma.
Pretranscripcional.
- Secuencia reguladora de la transcripción que es reconocida por los factores de transcripción y se requiere para la unión de la ARNpol:
Promotor Mínimo
- Regiones codificantes del DNA que serán retiradas para la transcripción de los genes se llaman
Exones
- Mutaciones que no afectan al individuo donde ocurren pero si a su descendencia
Mutaciones germinales
- El síndrome de Ambras (hipertricosis) ocurre por una mutación por deleción de un fragmento cromosómico
Falso
- Regulación de la transcripción que puede implicar splicing alternativo.
Postranscripcional
- Propiedad del código genético que permite que cada triplete tenga un único significiado.
Unambiguo
- Sitio del ribosoma por donde entra el ARNt activado.
A
- Enzima del nucleolo que transcribe los genes que codifican para los ARNr.
ARN pol I.
- Secuencia reguladora de la transcripción que regula la maduración del ARNhn
silenciador***
- Cuando tenemos una secuencia de ADN que corresponde al número -10, nos referimos al:
Nucleótido que está 10 posiciones corriente abajo***
- El péptido señal se en el extremo C-terminal para la translocación de la proteína al retídulo endoplásmico.
Falso***
- Implica la participación de la aminoacil-RNAt sintetasa
Activación
- Codón de inicio
AUG
- Sitio del ribosoma en donde se forma el enlace peptídico con el aminoácidos entrante y ocurre la elongación.
Sitio P.
- En la nomenclatura 8q21.2, el número 2 después del punto correspondiente a:
Sub-banda.
- Propiedad del código genético que permite que algunos aminoácidos sean codificados por más de un codón.
Degenerado
- Factor transcripcional que tiene actividad helicasa, ATPasa y abre paso a la correspondiente polimerasa.
TFIIH
- En la nomenclatura 8q21.2, la letra correspondiente a:
Brazo del cromosoma
