Lab 2do parcial Flashcards
Genoma
Genes únicos:
- específicos del tejido
- de mantenimiento
ADN repetitivo:
- ADN satélite: alfa, mini, micro
- Repeticiones dispersas: SINE LINE
Factores físicos, químicos y biológicos que pueden causar daño al DNA. De no repararse puede desembocar en una mutación.
Mutágenos exógenos
Alteración en la secuencia del DNA de un individuo que se transmite por herencia a sus descendientes. Nunca se produce por consecuencia de la combinación meiótica entre cromosomas homólogos.
Mutación
Mutaciones causadas por - - errores en la replicaciones
-alteración espontánea de nucleótidos
Mutaciones endógenas
- Cambio en la estructura del DNA: formación de aductos.
- Daño a los cromosomas: Rompimientos de cadena.
Tipo de mutación
Podría no tener ningún efecto en la conformación función de la proteína.
Mutación silenciosa
-Una base nitrogenada o varias.
-Substitución de bases (transiciones o transversiones que también pueden deberse a que la DNA polimerasa no es 100% precisa).
-Corrimiento del marco de lectura (por inserciones o deleciones.
Generar una proteína incompleta o no funcional.
Las mutaciones pueden afectar a…
Intercambio de una parte del cromosoma por otra de un cromosoma distinto, que cambia las secuencias de bases del SNA.
Traslocaciones entre cromosomas
- Alteración en una base
- Alteración de dos bases.
- Rompimiento de la cadena.
- Entrecruzamiento.
Daño de DNA por agentes físicos, químicos se clasifican en:
- Despurinación
- Desaminación de citocina en uracilo.
- Desaminación de adenina en hipoxantina.
- Alquilación de la base.
- Inserción o separación de un nucleótido.
- Incorporación de un análogo a las bases.
- Alteración en una base
- Dímero de timina-timína inducido por luz UV.
- Entrecruzamiento por agentes de alquilación bifuncional.
- Alteración de dos bases
Radiación ionizante
- Desintegración radiactiva de elemento del esqueleto
- Formación de radicales libres oxidantes
- Rompimiento de la cadena.
- Entre bases de la misma cadena o de cadenas opuestas.
- Entre DNA y moléculas de proteínas.
- Entrecruzamiento.
sistemas que permiten
detectar las lesiones y corregirlas inmediatamente en el DNA.
Revisión directa del daño
sistemas que permiten
detectar las lesiones y corregirlas ANTES de la siguiente replicación del DNA, pudiendo eliminar solo UNA base nitrogenada.
Daño espontáneo, por agentes químicos o radiación a una base.
La enzima uracilo DNA glucosidasa remueve el uracilo creado por una desaminación espontánea de la citocina en el DNA. Una ENDONUCLEASA corta el esqueleto cerca del defecto; después de que una endonucleasa remueve algunas bases, el defecto es llenado por la acción de la polimerasa de reparación y la cadena se une de nuevo por una LIGASA.
Sistema de reparación por escisión de bases o BER
sistemas que permiten
detectar las lesiones y corregirlas antes de
la siguiente replicación del DNA, eliminando TODO el NUCLEÓTIDO.
Daño espontáneo, por agentes químicos
o radiación, en un segmento del DNA; este mecanismo se emplea para corregir GRANDES DEFECTOS en el DNA y, por lo general, involucra MÁS PROTEÍNAS que el mal apareamiento y
la reparación por escisión de bases. Después del reconocimiento del defecto y del
desenrollado del DNA que acompaña al defecto, una escisión por una NUCLEASA
(exonucleasa) corta un oligonucleótido de aproximadamente 30 nucleótidos por arriba y por debajo de la región defectuosa. Este intervalo es llenado por una POLIMERASA y vuelto a ligar.
Sistema de reparación por escisión de NUCLEÓTIDOS o NER.
sistemas que permiten
detectar las lesiones y corregirlas antes de
la siguiente replicación del DNA, eliminando aductos. por debajo de la región defectuosa. Este intervalo es llenado por una polimerasa y vuelto
a ligar. Este mecanismo corrige UN solo apareamiento erróneo de pares de bases (una base, o lazadas de 2 a 5 bases no apareadas) o una
REGIÓN CORTA de DNA no apareado. La región defectuosa es reconocida por una ENDONUCLEASA que hace un corte en la cadena sencilla en una secuencia GATC METILADA ADYACENTE, el fragmento mutado es removido (digestión por EXONUCLEASA), reemplazado y
ligado.
sistema de reparación de apareamientos erróneos/ Del mal apareamiento
sistema de reparación de apareamientos
erróneos detectando errores una vez replicado.
Síntesis translesión.
Daño por radiación ionizante, quimioterapia, radicales libres oxidantes. Las proteínas Ku y PROTEINCINASA DEPENDIENTE DEL DNA se combinan para aproximar las dos cadenas (sinapsis) y desenrollarlas. Los fragmentos alineados forman pares de bases; las terminales extras son removidas y los intervalos son llenados, y la continuidad es restaurada por ligado.
Reparación del rompimiento de la doble cadena.
xerodermia pigmentosa, el síndrome de Cockayne,
el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, la ataxia-telangiectasia y la anemia de
Falconi.
Enfermedades atribuidas a defectos en genes que codifican proteínas de reparación del DNA. Estos defectos conducen con frecuencia a una mayor
incidencia del cáncer, pues se produce una acumulación de mutaciones no corregidas.
Entre estas enfermedades destacan:
Monogénicas, exógenas, genéticas, poligénicas o
multifactoriales
Enfermedades moleculares
Técnica para la detección de entrecruzamiento de
cadenas, localización de daño en genes específicos, toxicología genética,
biomonitoreo y más recientemente para medición de la reparación del DNA en extractos celulares .
Ensayo cometa
Se basa en la migración diferencial del DNA al ánodo en un campo eléctrico, de manera dependiente del número de lesiones en los nucleoides y sitios de reparación transitorios, permitiendo visualizar rompimientos de cadena y sitios lábiles.
ENSAYO COMETA / ELECTROFORESIS UNICELULAR ALCALINA
Se basa en…
Consiste en embeber en agarosa suspensiones de un tipo de célula sobre un soporte sólido (portaobjetos) y someterlas a lisis con la finalidad de remover las membranas celulares y nucleares, así como las proteínas para dejar el DNA embebido en el gel. Una vez lisada la célula los nucleoides se someten a
desenrrollamiento en medio
alcalino o neutro (desnaturalización) y electroforesis. La migración de los fragmentos
resultantes se visualiza en un microscopio de fluorescencia después de teñir al DNA. Las preparaciones que al final proporcionen imágenes
redondas son nucleoides con escasa migración (daño), mientras que donde hay migración, el nucleoide forma una apariencia de “cometa”. El daño al DNA se obtiene con mediciones
de la relación cauda/núcleo de estas imágenes, observándose un aumento en el daño cuando el nucleoide pierde la forma redonda bien delimitada pasando la mayor parte del
DNA a la cauda.
¿En qué consiste el ensayo cometa?
Para demostrar que un fragmento de ADN contiene una secuencia de nucleótidos específica,
se puede construir una sonda de ADN complementario marcado radiactivamente, de
manera que reconozca y se una a la secuencia en el fragmento original de ADN. Las sondas radiactivas permiten a los biólogos moleculares localizar, identificar y comparar el ADN de diferentes personas. Esta sonda se puede describir como una etiqueta radiactiva que se unirá a una cadena simple de ADN y producirá una banda en un gel o una banda en una membrana de nylon que es una réplica del gel (Southern blot). Por su especificidad,
la sonda radiactiva se puede usar para demostrar similitudes genéticas entre individuos.
Las posiciones relativas de las bandas marcadas radiactivamente en un gel están determinadas por el tamaño de los fragmentos de ADN que las forman. El tamaño de los fragmentos indica variaciones en el ADN de cada individuo.
ADN Fingerprinting
utilizando DNA total digerido con enzimas de restricción y separado mediante electroforesis en gel de agarosa, lo que permite analizar y comparar el patrón debandeo de los diferentes individuos.
análisis de
ADN fingerprinting
ejidos, fluidos corporales (sangre y semen), folículos pilosos, etc. El análisis de ADN se puede hacer incluso de material desecado, como una mancha de sangre o tejido momificado. Si la muestra de ADN es muy pequeña se podría amplificar
utilizando la PCR. podrás obtener datos del análisis del patrón electroforético que te permitirán determinar si las muestras de ADN que te serán
proporcionadas son del mismo individuo o de varios diferentes.
La muestra necesaria para esta técnica se puede obtener de cualquier material biológico
que contenga ADN:
varias enzimas en las bacterias, las cuales cuando se añadían a cualquier ADN rompían (hidrolizaban) los enlaces entre las moléculas de azúcar fosforilado, actuando de forma específica en algunas secuencias de bases (sitios de reconocimiento). Esto producía la ruptura de la doble cadena de ADN en el sitio de reconocimiento y la molécula de ADN se fracturaba en dos fragmentos. Estas tijeras moleculares o enzimas hidrolíticas son las endonucleasas de restricción.
En 1968, el Dr. Werner Arber de la Universidad de Basel, Suiza, y el Dr. Hamilton Smith de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, descubrieron…
Se sitúan en la molécula de ADN y se desplazan por la hélice hasta que reconocen unas secuencias específicas de pares de bases que indican a la enzima que deje de desplazarse. Las enzimas entonces digieren (separan químicamente) la molécula de ADN en ese punto (llamado “diana de restricción”) actuando como tijeras moleculares, cortando el ADN por secuencias específicas de pares de bases.
enzimas de restricción
la enzima de restricción
cortará en cada uno de esos sitios, obteniéndose múltiples fragmentos. Así, si un fragmento lineal de ADN se corta con una enzima de restricción cuya diana de restricción se encuentra en dos puntos diferentes de la molécula de ADN, se obtendrán tres
fragmentos de diferentes longitudes. La longitud de cada fragmento dependerá de la localización de las dianas de restricción en la molécula de ADN.
Si existe más de una diana de restricción en una molécula de ADN
de los biólogos moleculares. Cuando una determinada enzima de restricción reconoce una secuencia de reconocimiento (de 4 o 6 pares de bases) en un fragmento de ADN, corta la molécula en ese punto. Las secuencias de reconocimiento de dos enzimas usadas habitualmente, EcoRI y PstI, aparecen a continuación.
enzimas de restricción son las “tijeras químicas”
tampón (buffer)
y a una temperatura específicos. El buffer utilizado en esta práctica contiene Tris 50 mM,
NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, DDT 1 mM, pH 8.0, que son las condiciones ideales para el funcionamiento correcto de las enzimas EcoRI y PstI.
enzimas de restricción
La electroforesis separa los fragmentos de ADN en función de su tamaño. Los fragmentos de ADN se cargan en un gel de agarosa, que se sitúa en una cubeta que contiene una solución líquida conductora. La corriente eléctrica pasa a través de dos electrodos situados en cada extremo de la cubeta. Los fragmentos de ADN están cargados negativamente, y cuando se sitúan en un campo eléctrico migrarán hacia el polo positivo. La matriz del gel de agarosa actúa como un tamiz molecular a través de la cual los fragmentos pequeños de ADN se pueden mover con más facilidad que los más grandes. Tras cierto tiempo, los fragmentos pequeños avanzarán más que los más grandes. Los fragmentos del mismo tamaño permanecen juntos y migran juntos produciendo una sola banda de ADN.
Electroforesis en gel de agarosa
El ADN es incoloro, de manera que los fragmentos de ADN no se pueden ver en el gel durante la electroforesis. Se utiliza un tampón de carga, que contiene dos colorantes azules, y que se añade a la solución de ADN. Los colorantes no tiñen el ADN, pero facilitan la carga de los geles y permiten ver el avance de la electroforesis. Los colorantes migran hacia el polo positivo situado al final del gel, al igual que los fragmentos de ADN. El colorante “rápido” migra con los fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pb, mientras que el colorante “lento” migra con los fragmentos de ADN de tamaño aproximado de 5 kpb.
Visualización de los fragmentos de restricción
Cuando el gel se sumerge en una solución diluida de colorante Bio-Safe, las moléculas del colorante se unen a las moléculas de ADN atrapadas en el gel de agarosa. Para aumentar el contraste y visualizar con
facilidad las bandas de ADN, el exceso de colorante se puede eliminar del gel destiñéndolo con agua. Cuando las bandas sean visibles será posible comparar los patrones de restricción de diferentes muestras de ADN.
La tinción del ADN muestra su localización en el gel
Comparación de los patrones electroforéticos de la escena del crimen con cada una de las muestras analizadas de los
sospechosos.
Cualitativa
Minisatélites
de 20 a 70 pb
Existen dos familias: la telomérica y la hipervariable
Función de los telómeros: mantener la integridad del cromosoma en la replicación, evitar la degradación y pérdida de material genético
DNA minisatélica hipervariable
Localizado en regiones subteloméricas, y dispersas
Secuencias altamente polimórficas, más de 1000 arreglos diferentes
Tamaño de 0-1-20 Kb secuencias cortas y de 9 a 64 pb repetidas en tándem
Secuencias central 5” GGGCAGGAXG 3” señal de recombinación similar a la E. coli
Microsatélites
de 2, 3 o 4 pb en bloqueos pequeños de 150 pb
rara vez se encuentran en secuencias que codifican
los repetidos en trinucleótidos se localizan en o cerca de regiones codificantes y se relacionan con genes en enfermedades hereditarias
Microsatélites
Enfermedad: Kennedy Secuencia repetida: CAG Número normal: 11-33 Número si hay enfermedad: 40-62 Localización: Región codificante de la proteína
Enfermedad: Huntington Secuencia repetida: CAG Número normal: 11-34 Número si hay enfermedad: 42-100 Localización: región codificante de la proteína
Enfermedad: X frágil Secuencia repetida: CGG Número normal: 6-54 Número si hay enfermedad: 250-4000 Localización: Región sin traducir en 5"
Enfermedad: Distrofia miotónica Secuencia repetida: CTG Número normal: 5-30 Número si hay enfermedad: mayor a 50 Localización: Región sin traducir
Polimorfismos
- Son variaciones en las secuencias de DNA
- Frecuentes en el genoma
- Se localizan en regiones codificadoras y no codificadoras
Dos tipos de polimorfismos
(a) secuencia de polimorfismos
AGACTAGACATT
AGATTAGGCATT
(b) polimorfismo de longitud
(AATG)(AATG)(AATG)
3 repeticiones
(AATG)(AATG)
2 repeticiones
Muestra obtenida de la escena del crimen o investigación de paternidad: BIOLOGÍA
Extracción de DNA
cuantificación de DNA
amplificación PCR de multiples marcadores STR
Muestra obtenida de la escena del crimen o investigación de paternidad: Tecnología
Separacion y deteccion de productos PCR (alelos STR)
Muestra determinación genotípica
Muestra obtenida de la escena del crimen o investigación de paternidad: geneticas
- comparación del genotipo de la muestra con otros
resultados de la muestra - Si se produce coincidencia, comparación del perfil de ADN con las bases de datos de población
- generación de informe de caso con probabilidad de coincidencia aleatoria
Una breve historia de la genética forense
- evento
- transferencia de material
- identificación / colección de material
- caracterización de material
- extracción de DNA
- cuantificación de DNA
- amplificación PCR
- detección de productos PCR (perfil genético)
- estadística de la evaluacion del perfil del DNA
- reporte
sangre líquida
cantidad de adn:
20,000-40,000 ng/mL
mancha de sangre
cantidad de adn:
250-500 ng/cm2
líquido seminal
cantidad de adn:
150,000-300,000 ng/mL
hisopo post-cito vaginal
cantidad de adn:
10-3000 ng/swab
cabello arrancado
cantidad de adn:
1-750 ng/root
cabello caido
cantidad de adn:
1-10ng/root
saliva
cantidad de adn:
1000-10,000 ng/mL
hisopo oral
cantidad de adn:
100-1500 ng/swab
orina
cantidad de adn:
1-20 ng/mL
hueso
cantidad de adn:
3.10 ng/mg
tejido
cantidad de adn:
50-500 ng/md
Enzimas de restricción
1950: se identifica sistema de restricción-modificación, en procariotas y bacteriófagos.
cohen y boyer asignan el término
Stweart Linn y werner Arber en los 60” descubren las endonucleasas en E. Coli
endonucleasas de restricción
previenen la invasión de ADN foráneo tal como el viral cortándolo
Estas “restringen” un rango de cierto tipo de virus en determinados hospederos
enzima:
alul
Secuenciade reconocimiento
AG CT
enzima:
BamHl
Secuenciade reconocimiento
G GATCC
enzima:
Bglll
Secuenciade reconocimiento
A GATCT
enzima:
CLAI
Secuenciade reconocimiento
AT CGAT
enzima:
EcoRI
Secuenciade reconocimiento
G AATTC
enzima:
HaeIII
Secuenciade reconocimiento
GG CC
enzima:
Hindll
Secuenciade reconocimiento
GTPi PuAC
enzima:
Hpall
Secuenciade reconocimiento
C CGG
enzima:
Kpnl
Secuenciade reconocimiento
GGTAC C
enzima:
Mbol
Secuenciade reconocimiento
GATC
enzima:
PstI
Secuenciade reconocimiento
CTGCA G
enzima:
PvuI
Secuenciade reconocimiento
CGAT CG
enzima:
Sall
Secuenciade reconocimiento
G TCGAC
enzima:
small
Secuenciade reconocimiento
CCC GGG
HindIII
- Algunas enzimas de restricción, como HindIII, hacen cortes escalonados en el ADN.
- … produciendo extremos monocatenarios cohesivos (pegajosos)
- otras enzimas de restricción, como Pvull
- … cortar ambas hebras de ADN en línea recta, produciendo extremos romos
Nomenclatura de los marcadores STR
-Marcador parte de un gen o esta en el gen: HUMTH01: Gen TH tirosina hidroxilasa 01 porción de la repetición (intrón 1) HUM genoma humano
-Marcador fuera del gen, se puede designa posición del cromosoma STR loci
D16S539
D: DNA
16:cromosoma 16
S: copia única
539: orden en el que el marcador fue categorizado en el cromosoma
En el lugar de los hechos se encontraron diferentes evidencias que señalaban que ahí se había cometido un crimen.
Se utilizó la técnica de Huella genética para identificar al culpable.
- Recolecta de a muestra
- Extracción de ADN
diagrama de la vict
(descripción de forma general del procedimiento por el que se realizo la extracción del ADN de la víctima, EC y sospechosos)
- Análisis de secuencias de ADN
A partir del ADN extraído de EC y sospechosos se realizó la técnica de huella genética para identificar al culpable
Se utilizaron RFLP y se identificaron utilizando dos enzimas de restricción EcoRl y Pstl
Después de la digestión de ADN se realizo amplificación por PCR
Los fragmentos obtenidos se separaron y revelaron por electroforesis en gel de agarosa.
EXAMEN 2DO PARCIAL
EXAMEN 2DO PARCIAL
- Las enzimas de restricción tiene como finalidad en su hospedero productor original
Evita la infección de Material genético foráneo.
- ¿Cuál imagen corresponde a la célula con menor daño?(lm1)
0**
- Es el último paso experimental de la técnica de huella génica
Electroforesis y documentación.
- ¿Por qué se requiere correr un marcador de pesos moleculares en la electroforesis?
Para calcular el peso de las otras bandas.
- Indique que tipo de corte realizan las enzimas del Kit de huella génica del laboratorio
Romo
- Condición característica de la electroforesis del ensayo cometa
pH ácido.
- Se tiene que realizar un corte de una muestra de ADN forense para la determinación de secuencias indique que tipo de enzimas utilizaría.
Restricción ***
- A partir de la imagen (lm5) indique ¿Cómo se le llama a la zona de la imagen que tiene menor densidad e intensidad?
Cola***
- Se muestra una imagen (lm2) resultado de un análisis de huella genética realizado a dos muestras de sangre encontradas en la escena de un crimen: indique cuales carriles corresponden a la víctima del crimen.
- Víctima
- Escena del crimen 2
- La huella génica tiene múltiples usos y nos ayuda a discernir entre muestras génicas EXCEPTO en:
En antropología para migraciones culturales¨**
11.Analiza los siguientes patrones de corrimientos electroforéticos de STR y en base a este indica cual es la opción del resultado de paternidad (Imp4)
Padre B. madre incorrecta**
- Indique cual es el orden correcto de la técnica de COMETA:
a) Exposición o administración del mutágeno.
b) obtención de la muestra celular.
c) Preparación de los portaobjetos de agarosa con la muestra
d) lisis celular
e) Unwending en solución alcalina.
f) Corrimiento electroforético
g) Neutralización
h) Tinción de Bromuro de etidio
i) Análisis en el microscopio.
a, b, c, d, f, e, g, h, i
13.La electroforesis es una técnica de separación mediante el flujo de una corriente eléctrica a través de un gelque contiene a la muestra a separar, cual es el criterio de separación utilizado:
Densidad
- Es el segundo paso en la técnica de la huella génica:
Extracción del DNA
- Endonucleasas utilizadas experimentalmente el laboratorio para la técnica de huella génica
Eco RI/Pstl
- Marcadores de peso molecular utilizados en la práctica de huella génica
13 bandas.
- De la siguiente fotografía que cometa representa el grado de daño mayor en comerta (Im6)
B
18.En la siguiente imagen (Im5) cual es la opción correcta que describe la cabeza, la cola y el grado de daño.
El punto A es la cabeza y B es la cola que describen daño grado 1
- Si requiere evaluar una muestra de paternidad indique cuantos STR utilizaróa
15
