La chromatographie

Question 1

Quelles sont les deux phases utilisées par la chromatographie ?

Answer 1

La phase mobile et la phase stationnaire.

Question 2

Qu’est-ce qui permet le ralentissement des substances lors de l’élution chromatographique ?

Answer 2

Les interactions avec la phase stationnaire selon les propriétés respectives des substances.

Question 3

Quelles sont les propriétés utilisées pour effectuer le fractionnement ?

Answer 3

Les interactions ioniques, la taille et la spécificité ?

Question 4

Quelle méthode chromatographique utilise-t-on pour effectuer un fractionnement basé sur les interactions ioniques ?

Answer 4

Chromatographie par échange d’ions.

Question 5

Quelle méthode chromatographique utilise-t-on pour effectuer un fractionnement basé sur la taille ?

Answer 5

La chromatographie par gel-filtration.

Question 6

Quelle méthode chromatographique utilise-t-on pour effectuer un fractionnement basé sur la spécificité ?

Answer 6

La chromatographie par affinité.

Question 7

Quelle charge porte les groupes d’un échangeur de cations (R) ?

Answer 7

Négative.

Question 8

Quelle charge porte les groupes d’un échangeur d’anions (R) ?

Answer 8

Positive.

Question 9

Comment fonctionne brièvement un échangeur d’ions ?

Answer 9

Les ions liés électrostatiquement à un support insoluble (R) sont remplacés de manière réversible par des ions en solution.

Question 10

Pourquoi est-ce que l’affinité des protéines pour l’échangeur d’ions dépend du pH ?

Answer 10

Puisque la charge nette des protéines dépend du pH.

Question 11

Pourquoi est-ce que l’affinité des protéines pour l’échangeur d’ions dépend de la nature et des concentrations des autres ions en solution ?

Answer 11

Ceux-ci vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions.

Question 12

De quoi dépend intrinsèquement l’affinité de l’échangeur (R) pour leur protéine en chromatographie ?

Answer 12

La nature de leur matrice et le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine.

Question 13

Qu’est-ce qu’une matrice en chromatographie ?

Answer 13

Ce sont des polymères insolubles préparés sous formes de billes, appelées familièrement résine. (cellulose ou agarose)

Question 14

Que peut-on dire sur la porosité de la matrice chromatographique ?

Answer 14

Le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la surface de l’extérieur de la bille.

Question 15

Qu’est-ce qu’un échangeur d’ions forts comparé à un échangeur d’ions faible ?

Answer 15

L’échangeur d’ions fort reste chargé malgré une grande variation de pH (3-10), tandis que l’échangeur faible reste chargé dans une zone plus restreinte.

Question 16

Comment est-ce que les échangeurs d’ions exploitent une charge nette sur une protéine ?

Answer 16

Par attraction électrostatique.

Question 17

Quels sont les groupements chimiques greffés sur les matrices et leur charge/force ?

Answer 17

QAE (anionique fort), sulfonates (cationique fort), DEAE (anionique faible) et CM (cationique faible)

Question 18

Qu’est-ce que la protéine doit déplacer pour s’attacher à l’échangeur d’ions ?

Answer 18

Les contre-ions.

Question 19

Qu’est-ce que la protéine doit posséder pour pouvoir s’attacher à l’échangeur d’ions ?

Answer 19

Une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer.

Question 20

Pour permettre à la protéine de s’attacher à l’échangeur, que contrôle-t-on en solution ?

Answer 20

Le pH et la concentration saline.

Question 21

Avec quoi est lavé la colonne lors de la chromatographie par échange d’ions ?

Answer 21

Une solution tampon.

Question 22

Que peut-on dire sur la vitesse de migration des protéines par rapport à leur affinité avec l’échangeur d’ions ?

Answer 22

Plus l’affinité de la liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus elle sera retardée.

Question 23

Que peut-on faire pour augmenter la vitesse d’élution d’une protéine ?

Answer 23

L’utilisation d’un tampon de concentration saline (KCl ou NaCl) supérieur au tampon de lavage.

Question 24

Qu’est-ce qu’une élution fractionnée ?

Answer 24

C’est l’ajout drastique d’une concentration saline. Cette augmentation permet d’éluer les protéines dépendamment de leur affinité avec le sel par plateau. Lorsque toutes les protéines avec l’affinité pour une certaine concentration en sel sont éluées, on augmente la concentration saline.

Question 25

Qu'est-ce que l'élution par gradient de concentration.

Answer 25

Au lieu de former des plateaux comme avec l'élution fractionnée, on augmente linéairement et continuellement la concentration en sel.

Question 26

Quel est le principe de la chromatographie par gel filtration ou tamis moléculaire ?

Answer 26

1. La phase stationnaire (résine) consiste en un réseau de polymères réticulés possédant des, fabriqués sous forme de billes. 2. Il y a une limite d'exclusion laissant seulement passer les petites molécules dans les pores. 3. Les molécules plus grandes ne pénètrent pas dans les pores que les protéines retenues dans les pores des billes.

Question 27

Quelles sont les matrices utilisés pour la chromatographie par gel-filtration ou tamis moléculaire ?

Answer 27

La dextrane, l'agarose ou le polyacrylamide.

Question 28

De quoi dépend la porosité des gels ?

Answer 28

De la masse moléculaire du polymère et du nombre de liaison croisées qui se forment entre les molécules du polymères (pontages).

Question 29

Dans une chromatographie gel-filtration ou tamis moléculaire, quelle taille de protéine est éluée en premier ?

Answer 29

Les plus grosses.

Question 30

Qu'est-ce que le volume d'élution d'une protéine (Ve) ?

Answer 30

C'est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne. Vt=Vx+V0. Il est possible de mesurer le volume d'élution relatif (Ve/V0)

Question 31

À quoi sert de mesurer le volume d'élution relatif ?

Answer 31

Estimer la masse moléculaire de la protéine. Il existe une relation linéaire entre le volume d'élution relatif d'une protéine et le logarithme de sa masse moléculaire.

Question 32

Que signifie les paramètres Vx, V0 et Vt ?

Answer 32

Vx volume occupé par les billes, V0 volume mort (solvant entourant les billes) et Vt le volume total de la colonne.

Question 33

Que permet la dialyse ?

Answer 33

Elle permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l'utilisation de membranes semi-perméables. (cellulose)

Question 34

Quelles tailles de molécules passent en premier lors d'une dialyse ?

Answer 34

Les plus petites.

Question 35

Pourquoi est-ce que la dialyse est fréquemment utilisée ?

Answer 35

Pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après la précipitation.

Question 36

Comment fonctionne la chromatographie sur colonne filtre ?

Answer 36

En centrifugeant, les molécules de tailles inférieures aux pores du filtre passent alors que les autres restent. On peut ainsi isoler les protéines selon leur taille.

Question 37

Qu'est-ce que la chromatographie par affinité ?

Answer 37

Un ligand qui lie spécifiquement à la protéine d'intérêt, est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte. Les protéines se s'y liant pas passe à travers la colonne alors que la protéine d'intérêt y reste.

Question 38

Comment récupère-t-on la protéine d'intérêt lors d'une chromatographie par affinité ?

Answer 38

On récupère la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant les conditions d'élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand. (changement de pH, force ionique, température ou ligands libres)

Question 39

La chromatographie d'affinité utilise des propriétés physiques ou chimiques ?

Answer 39

Chimiques.

Question 40

Quelle est l'avantage de la chromatographie d'affinité au niveau du temps ?

Answer 40

Rapide, en une seule étape.

Question 41

Que signifie Kd ?

Answer 41

La constante de dissociation (une mesure de l'affinité protéine-ligand)

Question 42

De quoi dépend l'efficacité de l'interaction protéine ligand (chromatographie d'affinité) ?

Answer 42

Du Kd, de la concentration de la protéine dans l'extrait et du degré de liaison du ligand à la matrice.

Question 43

Quelles sont les caractéristiques d'une bonne matrice pour la chromatographie d'affinité ?

Answer 43

Chimiquement inerte, avoir une grande porosité et présenter de nombreux groupes fonctionnels capable de former des liens avec les ligands.

Question 44

Comment fait-on pour éviter le problème de l'interférence stérique avec la matrice de l'agarose en présence de bromure de cyanogène ?

Answer 44

Avec une bras espaceur.

Question 45

Comment se fait la liaison du ligand à la matrice ?

Answer 45

1. L'agarose réagi avec le bromure de cyanogène qui produit un intermédiaire activé et stable. 2. Le ligand réagit avec l'agarose activé pour donner un produit lié par covalence.

Question 46

Quelles sont les méthodes utilisées pour détecter quantitativement et spécifiquement les protéines dans les différentes fractions de l'éluats ?

Answer 46

Absorption des protéines dans l'UV (280 nm), essai calorimétrique, essai enzymatique, détection de la protéine sur gel SDS-PAGE et détection de la protéine avec un anticorps.