Isolation des protéines Flashcards
Quelle est la première étape dans la purification des protéines ?
Les dissoudre dans une phase liquide.
Comment fait-on pour libérer des protéines des cellules dans lesquelles elles se trouvent ? En quoi est-ce que cette méthode consiste ?
La lyse mitotique, ouè les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique.
Qu’est-ce qu’une solution hypotonique ?
Solution dont la concentration molaire en solutéest inférieure à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule.
Comment est-ce qu’une solution hypotonique peut percer la membrane d’une cellule ?
La différence de concentration résulte dans l’établissement d’une pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule.
Comment fait-on pour dégrader la paroi des cellules bactériennes, végétales ou des levures ?
L’utilisation de lysozyme, une enzyme qui dégrade les parois cellualaires est nécessaire.
Quelles sont les cinq (5) façons de briser les tissus renfermant les cellules à l’étude ?
Le broyage, le déchiquetage mécanique, l’homogénisateur, la rupture à haute pression (French Press) et la sonication.
Quelle méthode d’isolation est utilisé à la suite de la lyse cellulaire et pourquoi ?
La centrifugation afin d’enlever les particules ou débris cellulaires, laissant la protéine d’intérêt dans le surnagent de la solution.
Comment peut-on s’assurer que sa protéine n’est pas contaminé avec d’autres organites cellulaires ?
Avec des marqueurs moléculaires (pour chaque organite)
Qu’est-ce que la centrifugation différentielle ?
La centrifugation à différente force/temps pour isoler des organites, molécules, virus ou tissus selon leur taille.
Quels sont les trois facteurs qui peuvent dénaturer les protéines et comment les éviter ?
Le pH (garder à pH physiologique), la température (rester en dessous de 25 degrés et conserver entre -20 à -80 degrés) et les protéases (ajout d’inhibiteur protéiques).
Quelles sont les propriétés physicochimiques qu’utilisent les méthodes de fractionnement (4) ?
La solubilité, la charge ionique, la taille moléculaire et les propriétés d’asporption et de liaison à d’autres molécules biologique.
Quel est l’objectif des méthodes de fractionnement qui utilisent la solubilité ?
La précipitation.
Quelles sont les méthodes de fractionnement qui utilisent la charge ionique ?
Chromatographie par échange d’ions, électrophorèse et focalisation isoélectrique.
Quelles sont les méthodes de fractionnement qui utilisent la taille moléculaire ?
Ultracentrification, chromatographie par gel-filtration, électrophorèse. (colonne filtre)
Quelles sont les méthodes de fractionnement qui utilisent la spécificité ?
La chromatographie par affinité.
Grossièrement, comment fait-on une précipitation ?
On diminue sélectivement la solubilité de la protéine dans l’eau.
De quoi dépend la solubilité d’une protéine ?
Des intéractions polaires avec le solvant acqueux, des interactions ioniques avec sels sels en solution et des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire.
Comment fonctionne la précipitation en milieu acqueux avec les protéines ?
Les protéines avec le plus do solubilité ont une bonne affinité avec les solvants et/ou les sels qui s’y trouve. Les protéines peu soluble font plus d’intéractions protéines-protéines qu’avec le solvant. À une certaine taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour contrecarer la force gravitationelle et on observe une précipitation.
Quels sont les variations utilisés pour diminuer la solubilité d’une protéine ?
La force ionique, le pH et l’ajout de solvants organiques.
Comment exprime-t-on la concentration de sel dissous dans une solution ? Quelles sont les varaibles ?
La force ionique dépendant de ci la concentration et Zi la charge électrique.
Quelle est la tendance générale de solubilité d’une protéine lorsque l’on augmente la quantité de sel en solution ?
Sa solubilité augmente
Qu’est-ce que le salting in ?
C’est la zone de force ionique de 0 à 0,5 M. À ces concentrations, les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette.
Quelles sont les conséquences de l’augmentation des charges nette de la protéine ?
Les sels augmentent les intérations avec l’eau et les sels augmentent la répulsion entre protéines. (diminution de l’agrégation)
Qu’est-ce qu’un dessalage par dialyse ?
Elle permet de contrer un tampon de faible force ionique permettant de faire précipiter les protéines.
Qu’est-ce que le salting out ?
La séquestration de l’eau par les ions salins diminuant la salvatation des protéines dans le solvant. Les régions hydrophobes seront les prémières à être moins bien hydraté et ainsi à précipité.
À quoi est dû le salting out ?
Ce phénomène est dû essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés et les protéines pour la salvatation. (L’accès à l’eau)
Qu’elle région de la protéine est impliqué dans le dessalage ?
Les régions hydrophobes sur la surface protéique.
Qu’est-ce que la chaotropicité des sels ?
Les sels qui se lient et intéregissent directement avec la protéines peuvent avoir un effet déstabilisant.
Qu’est-ce que les sels optimaux ?
Ils encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéines sans avoir aucune intéraction avec la protéine.
Qu’est-ce que la série Hofmeister ?
C’est une échelle montrant que certains ions favorisent la précipitation des protéines à haute concentration (salting out) alors que d’autre favorisent la solubilisation à faible concentration (salting in).
Quel est le sel le plus couramment utilisé pour la précipitation des protéines ?
Le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4
Qu’est-ce que la précipitation différentielle ?
C’est la concentration exacte d’un sel pour faire précipiter certaines protéines alros que d’autres restent en solution.
Qu’est-ce que le point isoélectrique ?
Le pH auquel la protéine à une charge globale neutre.
Pourquoi est-ce qu’au charge neutre, les protéines ont plus tendance à précipité ?
Ils minimisent la répulsion entre protéine et forment ainsi des agrégats qui précipitent. (précipitation isoélectrique)
Qu’arrive-t-il au pouvoir de solubiliser de l’eau en présence de solvant organique ?
Son pouvoir de solubilisé des molécules chargés décroît avec la concentration du solvant organique en solution.
Pourquoi est-ce que le pouvoir de solubiliser de l’eau réduit en présence de solvant organique ?
La réduction de la constante diélectrique de l’eau : pouvoir de solvatation des ions dissous (comme les protéines). Les régions des protéines de charges oppsosées s’attirent et forment des agrégats qui précipitent.
Quel est le rapport entre la taille et la solubilité en présence de solvant organique ?
Plus la protéine est grande, plus elle aura de la facilité à solubiliser.
