Isolation des protéines

Question 1

Quelle est la première étape dans la purification des protéines ?

Answer 1

Les dissoudre dans une phase liquide.

Question 2

Comment fait-on pour libérer des protéines des cellules dans lesquelles elles se trouvent ? En quoi est-ce que cette méthode consiste ?

Answer 2

La lyse mitotique, ouè les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique.

Question 3

Qu’est-ce qu’une solution hypotonique ?

Answer 3

Solution dont la concentration molaire en solutéest inférieure à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule.

Question 4

Comment est-ce qu’une solution hypotonique peut percer la membrane d’une cellule ?

Answer 4

La différence de concentration résulte dans l’établissement d’une pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule.

Question 5

Comment fait-on pour dégrader la paroi des cellules bactériennes, végétales ou des levures ?

Answer 5

L’utilisation de lysozyme, une enzyme qui dégrade les parois cellualaires est nécessaire.

Question 6

Quelles sont les cinq (5) façons de briser les tissus renfermant les cellules à l’étude ?

Answer 6

Le broyage, le déchiquetage mécanique, l’homogénisateur, la rupture à haute pression (French Press) et la sonication.

Question 7

Quelle méthode d’isolation est utilisé à la suite de la lyse cellulaire et pourquoi ?

Answer 7

La centrifugation afin d’enlever les particules ou débris cellulaires, laissant la protéine d’intérêt dans le surnagent de la solution.

Question 8

Comment peut-on s’assurer que sa protéine n’est pas contaminé avec d’autres organites cellulaires ?

Answer 8

Avec des marqueurs moléculaires (pour chaque organite)

Question 9

Qu’est-ce que la centrifugation différentielle ?

Answer 9

La centrifugation à différente force/temps pour isoler des organites, molécules, virus ou tissus selon leur taille.

Question 10

Quels sont les trois facteurs qui peuvent dénaturer les protéines et comment les éviter ?

Answer 10

Le pH (garder à pH physiologique), la température (rester en dessous de 25 degrés et conserver entre -20 à -80 degrés) et les protéases (ajout d’inhibiteur protéiques).

Question 11

Quelles sont les propriétés physicochimiques qu’utilisent les méthodes de fractionnement (4) ?

Answer 11

La solubilité, la charge ionique, la taille moléculaire et les propriétés d’asporption et de liaison à d’autres molécules biologique.

Question 12

Quel est l’objectif des méthodes de fractionnement qui utilisent la solubilité ?

Answer 12

La précipitation.

Question 13

Quelles sont les méthodes de fractionnement qui utilisent la charge ionique ?

Answer 13

Chromatographie par échange d’ions, électrophorèse et focalisation isoélectrique.

Question 14

Quelles sont les méthodes de fractionnement qui utilisent la taille moléculaire ?

Answer 14

Ultracentrification, chromatographie par gel-filtration, électrophorèse. (colonne filtre)

Question 15

Quelles sont les méthodes de fractionnement qui utilisent la spécificité ?

Answer 15

La chromatographie par affinité.

Question 16

Grossièrement, comment fait-on une précipitation ?

Answer 16

On diminue sélectivement la solubilité de la protéine dans l’eau.

Question 17

De quoi dépend la solubilité d’une protéine ?

Answer 17

Des intéractions polaires avec le solvant acqueux, des interactions ioniques avec sels sels en solution et des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire.

Question 18

Comment fonctionne la précipitation en milieu acqueux avec les protéines ?

Answer 18

Les protéines avec le plus do solubilité ont une bonne affinité avec les solvants et/ou les sels qui s’y trouve. Les protéines peu soluble font plus d’intéractions protéines-protéines qu’avec le solvant. À une certaine taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour contrecarer la force gravitationelle et on observe une précipitation.

Question 19

Quels sont les variations utilisés pour diminuer la solubilité d’une protéine ?

Answer 19

La force ionique, le pH et l’ajout de solvants organiques.

Question 20

Comment exprime-t-on la concentration de sel dissous dans une solution ? Quelles sont les varaibles ?

Answer 20

La force ionique dépendant de ci la concentration et Zi la charge électrique.

Question 21

Quelle est la tendance générale de solubilité d’une protéine lorsque l’on augmente la quantité de sel en solution ?

Answer 21

Sa solubilité augmente

Question 22

Qu’est-ce que le salting in ?

Answer 22

C’est la zone de force ionique de 0 à 0,5 M. À ces concentrations, les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette.

Question 23

Quelles sont les conséquences de l’augmentation des charges nette de la protéine ?

Answer 23

Les sels augmentent les intérations avec l’eau et les sels augmentent la répulsion entre protéines. (diminution de l’agrégation)

Question 24

Qu’est-ce qu’un dessalage par dialyse ?

Answer 24

Elle permet de contrer un tampon de faible force ionique permettant de faire précipiter les protéines.

Question 25

Qu’est-ce que le salting out ?

Answer 25

La séquestration de l’eau par les ions salins diminuant la salvatation des protéines dans le solvant. Les régions hydrophobes seront les prémières à être moins bien hydraté et ainsi à précipité.

Question 26

À quoi est dû le salting out ?

Answer 26

Ce phénomène est dû essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés et les protéines pour la salvatation. (L’accès à l’eau)

Question 27

Qu’elle région de la protéine est impliqué dans le dessalage ?

Answer 27

Les régions hydrophobes sur la surface protéique.

Question 28

Qu’est-ce que la chaotropicité des sels ?

Answer 28

Les sels qui se lient et intéregissent directement avec la protéines peuvent avoir un effet déstabilisant.

Question 29

Qu’est-ce que les sels optimaux ?

Answer 29

Ils encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéines sans avoir aucune intéraction avec la protéine.

Question 30

Qu’est-ce que la série Hofmeister ?

Answer 30

C’est une échelle montrant que certains ions favorisent la précipitation des protéines à haute concentration (salting out) alors que d’autre favorisent la solubilisation à faible concentration (salting in).

Question 31

Quel est le sel le plus couramment utilisé pour la précipitation des protéines ?

Answer 31

Le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4

Question 32

Qu’est-ce que la précipitation différentielle ?

Answer 32

C’est la concentration exacte d’un sel pour faire précipiter certaines protéines alros que d’autres restent en solution.

Question 33

Qu’est-ce que le point isoélectrique ?

Answer 33

Le pH auquel la protéine à une charge globale neutre.

Question 34

Pourquoi est-ce qu’au charge neutre, les protéines ont plus tendance à précipité ?

Answer 34

Ils minimisent la répulsion entre protéine et forment ainsi des agrégats qui précipitent. (précipitation isoélectrique)

Question 35

Qu’arrive-t-il au pouvoir de solubiliser de l’eau en présence de solvant organique ?

Answer 35

Son pouvoir de solubilisé des molécules chargés décroît avec la concentration du solvant organique en solution.

Question 36

Pourquoi est-ce que le pouvoir de solubiliser de l’eau réduit en présence de solvant organique ?

Answer 36

La réduction de la constante diélectrique de l’eau : pouvoir de solvatation des ions dissous (comme les protéines). Les régions des protéines de charges oppsosées s’attirent et forment des agrégats qui précipitent.

Question 37

Quel est le rapport entre la taille et la solubilité en présence de solvant organique ?

Answer 37

Plus la protéine est grande, plus elle aura de la facilité à solubiliser.