konfokale Bildgebung & strukturierte Beleuchtung Flashcards
Prinzip der konfokalen Bildgebung?
ein punktförmiger Filter (Pinhole/Blende) kann Licht, das von einem Punkt ausgeht, effektiv filtern. Wenn Licht aus einem Punkt tiefer/höher kommt viel Licht wird gerausgefiltern (keine saubere Erkennung) Filterung von der Streuung der Punkte drunter und drüber
Konfokales Prinzip Systemaufbau ?
Punktförmige Quelle (δ-Peak) –> optisches System mit Transferfkt. H1/PSF h1 –> Probe mit Transmissivität (Reflektivität) t(x0)
–> transmittiertes (reflektiertes) Licht –> optisches System mit H2 –> Filterung durch Pinhole –>Intensität wird an der Stelle ausgewertet
Wie wird die Probe gescannt?
Ist die Auflösung höher als bei einer flächigen Beleuchtung?
Scannen wird über Translation der Probe berechnet Verschiebung von t um xs (Probe abrastern)
x0 beschreibt alle lateralen Positionen in der Probenebene
t(x0-xs) Transmission bei x0 Minus Scannerposition, da wir die Transmissivität um die gescannte Position verschoben haben wollen
- Konfokale Detektion: Licht (durch Pinhole) nur an Stelle x=0 detektieren
- Annahme radial-symmetrische PSF: h2(-x)=h2(x)
- Gesamt-PSF ergibt aus Produkt der beiden einzelnen Kollektor- und Emissions-PSFs
- Ansonsten entspricht es der kohärenten Bildgebung (Überlagerung der Felder, nicht der Intensitäten)
- Auflösung höher als bei flächiger Beleuchtung (mit zwei Foki (zwei PSFs Kollektor-und Emissions-PSF)))
Was beschreibt die defokussierte PSF und wie wird sie dargestellt?
konfokales Prinzip:
höhere Auflösung und …
Beschreibt, dass Licht außerhalb des Pinholes unterdrückt wird
- Quadratischer Phasenfaktor steht für Defokus der Distanz z (FresnelNäherung sphärische Kugelfront parabolisch angenähert)
- mit Besselfkt wegen sphärische Koordinaten
- keine Abhängigkeiten vom Setup: Wir wollen keine Abhängigkeit von der Größe der Apertur neutrale Variablen einsetzen (Messtiefe z, laterale Auflösung r, Frequenz kr ersetzen)
- e-Fkt durch cos,sin ersetzen
konfokale Sektionierung:
Bedeutung?
Wann bekommen wir eine bessere Sektionierung
Zusammenhang Auflösung und NA (Numerische Apertur: Auflösungsvermögen des verwendeten Objektivs) ?
– Je weiter wir von der Fokusebene weggehen, desto weniger Licht detektieren wir, wenn wir Integral auswerten
- Größere NA –>
bessere Sektionierung (Tiefendiskriminierung), weil die Tiefe über die wir Licht aufnehmen kleiner wird, Auflösung besser
- Durch Näherungen in Herleitung nur eingeschränkt!
- laterale Auflösung steigt linear mit NA (Je größer die NA wird, desto kleiner werden die Strukturen, die wir darstellen können
- axiale Auflösung steigt quadratisch mit NA
die Tiefe über die wir Licht detektieren wird quadratisch mit der NA kleiner bessere Unterdrückung von Tiefen, die nicht im Fokus liegen, wenn NA größer wird
Wie wird die konfokale Bildgebung realisiert/ wie wird gescannnt?
- Rasternd/Scannend
- Spinning Disk (mehrere Punkte gleichzeitig abgebildet, Mikrolinsendisk): schneller, kleinere Bildfelder, spezielle Kamera –> keine Photodetektor)
Wo wird das konfokale Prinzip eingesetzt?
- Hochauflösende 3D Bildgebung
- Fluoreszierende Proben
- OCT
Was sind die Vorteile des konfokalen Prinzips gegenüber der Weitfeldbildgebung?
- Einzelne Schichten werden getrennt aufgenommen
- Kein unscharfer Hintergrund
- Kein mehrfach gestreutes Licht
Was hat eher mit der COB zutun, als die KOnfokalmikroskopie?
Strukturierte Beleuchtung
- Super Auflösung durch eine Sammlung von Frequenzanteilen, die klassisch garnicht durch ein Objektiv jagen können
Strukturierte Beleuchtung bei inkohärenter Bildgebung. Prinzip
- Probe mit Intensitätsfeld beleuchten S(x) –> Beleuchtung mit Struktur/Helligkeitsverteilung –> Teil der Intensität (nicht Amplitude, sondern Intensität) zurück gestreut –> inkohärente PSF |h1|^2(x)
- Unterschiedliche Bereiche des lateralen Frequenzspektrums der Probe durch geschickt gewählte Struktur beleuchten –> höhere Auflösung
Sektionierung in strukturierter Beleuchtung, Prinzip?
Wir können Signale, die außerhalb des Fokus sind geschickt unterdrücken (hohe Frequenzen verlieren durch Defokus an Signal)
–> Struktur hat gewisse Frequenz –> wenn wir aus dem Defokus rausgehen wird die Frequenz unterdrückt –> unscharf –> Amplitude wird kleiner –> ob im Fokus oder nicht
Weg zur höheren Auflösung durch strukturierte Beleuchtung?
- Reflexion (|eta|^2) wird lateral verschoben im Frequenzraum: Fourier-Shift-Theorem Wir erhalten um ks verschobene Anteile (durch Phasenverlauf) des Frequenzspektrums Bilder für verschiedene ks nur …realisieren, da man mit der Intensität keine Phase und somit keine so komplexen Beleuchtungen bekommt
- Frequenzanteil lateral verschoben: anderen Teil des FSpektrums aufgenommen mehrere Male größere Auflösung
- FT von einem cos sind zwei δ-Peaks
- Messung mehrerer Phasen in Matrix darstellen die Anteile, die wir durch e^i Funktion (durch komplexe strukturierte Beleuchtung, die in Praxis unmöglich durchführbar) bekommen wollten stecken in Matrix die Anteile liefern uns die versch. Bereiche der FT
- Messung mit Matrix multiplizieren Rückschlüsse auf Fourierraum, den wir zusammensetzen können höhere Auflösung
Setup des strukturierten Beleuchtungsprinzips?
inkohärente Beleuchtung mit drehbarer Streifenstruktur (Gitter/DigitalMirrorDevice/Interferenz zweier kohärenter Wellen(nur bei Fluoreszenz)) Probe Rückgestreutes Licht auf Kamera
Prinzip: Drei Aufnahmen mit drei versch. Phasen im Fourierraum zusammensetzen (überlappen) ( Erfassung mehrerer Bilder mit phasenverschobener strukturierter Beleuchtung.) –> größerer Teil des Frequenzbereiches abgedeckt –> Darstellung kleinerer Strukturen im Ortsraum möglich –> größere Auflösung
Was gibt die Transferfunktion an? ATF/OTF
Informationen über welche Lichtstrahlen es durch schaffen (durch Linse)
Wie unterscheidet sich die OTF von der ATF?
Die ATF (kohärente TF) ähnlet einer Rechteckfunktion (für runde Apertur)–> 0 oder 1 von -1 bis 1 –> keine Frequenz wird abgeschwächt
Die OTF: Die Frequenzen reichen 2x so weit wie die der entsprechenden ATF –> hohe Frequenzen werden aber unterdrückt –> ähnelt der Kegelförmige Fkt.. bei H(0)=1
Also wenn Defokus (Zeta) =0 –> OTF =1
Was passiert, wenn wir einen Defokus einbauen? Was passiert mit der OFT und wie gut können wir Teile, die außerhalb des Fokus liegen unterdrücken?
- Aus ATF OTF versch. Zetas einsetzen Fkt fängt i-wann an für hohe Frequenzen zu kollabieren.
- Für kleine Frequenzen bleibt die Fkt gleich, denn den Gleichanteil kriegen wir egal was für ein Defokus durch die Transferfunktion durch
Sektionierung der strukturellen Beleuchtung
mit einer halben Cut-Off Frequenz kann man Frequenzen im Defokus am besten unterdrücken –> beste Halbwertsbreite starker Abfall der Frequenz K des Kontrastes mit Defokus nutzt man zur Sektionierung Probe mit Frequenz K beleuchten inkohärentes zurückgestreutes Licht behält nur Kontrast, wenn es im Fokus ist
- Defokussierter Anteil enthält in der Detektion keine Struktur mehr
Das Bild setzt sich aus dem defokussierten Anteil (Iout) und dem fokussierten Anteil (Iin)*S(x) mal die Struktur
Wodurch ist die strukturierte Beleuchtung limitiert?
1) Abhängig von der NA: Beleuchtungsoptik NA begrenzt Frequenzen der Strukturierung: max. 2K (inkohärent) oder K (kohärent bei Fluoreszenz) als Frequenz generierbar K hängt mit NA zusammen). Kontrast bei inkohärenter Beleuchtung reduziert.
2) - Sektionierung nicht mit kohärentem Licht Streifenmuster in FT nur 2 versch. Punkte Propagator (welche Phasen bekommen die Punkte) bekommen die gleiche Phase, da komplett radial symmetrisch am Ende ergibt sich dasselbe Bild das heißt ein Streifenmuster wird nicht unscharf in kohärenten Bildgebung also nicht durch Struktur die höhere Auflösung erreichen, sonder aus versch. Winkeln beleuchten (Phase bleibt ja erhalten) Streutheorie
- Gegensatz zur Konfokalmikroskopie erreichen die defokussierten Anteile trotzdem den Detektor nur numerisch rausfiltern
weitere Erhöhung der Auflösung der strukturierten Beleuchtung?
Was sind evaneszente Felder?
- Bei nicht-linearer Rückstreuung der Probe höhere harmonische Frequenzanteile (quadrate z.B.) größere Bereiche im Frequenzraum abdeckbar
- Evaneszente Felder: Frequenzen, die über den Bereich der Wellenlänge hinausgehen Feld kann noch kurz existieren reinprojizieren von kleineren Strukturen in die Probe
Dynamic Speckle Illumination (DSI) Mikroskopie ?
Speckle zur Erzeugung der Strukturierung
- Belichtung mit vielen bewegenden Specklemustern (drehen eines Diffusors) –> Detektion von Fluoreszenz
Bild: Specklemuster auf Probe - Nur fokussierte Specklemuster übertragen Frequenzen.
Fluktuation über Zeit aus Speckle-Bildern: - Teil im Fokus: es gab eine starke Fluktuation
- Defokus: kaum Fluktiation –> Speckle nicht scharf abgebildet
- Drehen des Diffusors –> Änderung des Bildes auf Kamera –> nur bei scharfem Anteil ändert sich die Intensität –> Teile (Pixel) des Bildes, die im Fokus sind extrahieren
- Viele Bilder benötigt für gute Bildquali
Was wäre eine Alternative/Weiterentwichlung zur Dynamic Speckle Illumination (DSI) Mikroskopie?
HiLo Mikroskopie –> nur zwei Bilder (Bild mit Specklen, Bild ohne Diffusor (flächige Beleuchtung oder drehen des Diffusors und lange beleuchten) —> wir mitteln räumlich/ nicht zeitlich
Theorie der HiLoMikroskopie
Verhältnis vom Mittelwert der Bilder und Standardabweichung bestimmen C(x) (gibt an welche Anteile im Fokus sind)
Gesamflutuationen C: Addition von Fluktuationen aus Objekt (Co)und aus strukturierten Beleuchtung (Cs) und das Produkt von beiden (Gleichanteil keine Rolle, da der im Fokus,Defokus erhalten bleibt) Co und C kennen Fluktuationen aus strukturierter Beleuchtung (Cs) bestimmen spezifiziert unabhängig von der Probenstruktur welche Anteile des Bildes fokussiert/defokussiert sind
niederfrequente, sektionierte Bildanteile seperieren durch Filter hochfrequente Anteile werden gefiltert (Hochpassfilter)
mittels Trennfrequenz zwischen Hi und Lo Stärke der Sektionierung
blinde strukturierte Beleuchtung
- Zufällige Specklemuster
- Summe der versch. Specklemuster gleichmäßige Beleuchtung: N+1 Gleichunugen bestimmbar
- Auch durch Entfaltung bessere Auflösung
