K6 ATPS Flashcards
pH des Phasensystemsbeinflusst
Nettoladungdes Proteins (Proteintitrationskurve)
- VerringertLadungseinflussauf Verteilung
- ÄndertProteinhydrophobizität
Verschiebt die Ladungsrelationen
BeeinflusstProteinlöslichkeit
- VerändertKapazität
- ZieloderFremdproteinekönnenausfallen
Strategie Flowchart zur Auswahl eines geeigneten ATPS Systems
Prinzip und Abtrennungsbestandteile
Vorteile und Parameter ATPS
Vorteile
- hohe Kapazität
- leichtes Scale up
- Hochdurchsatzprozess
- Konti
- günstige und sichere Bestandteile
Parameter
- Polymertyp
- Salztyp
- Distribution, Precipitaion
- Volumenverhältnis
- pH
- T
- Zusätze
*
Komponenten System
Polymere
- Polyethylglykol
- Dextran
- Ficole
Salz
- Phospaht
- Citrat
- Suplhat
Zusätze
- NaCl
- CaCl2
- Kl
- KCl
ATPS Phasendiagramm
Patameter Prozessdesign
- Distribution Koeffizient
- Volumenverhältnis
- Massenverhältnis
- Ausbeute
- Polymertyp
- Salztyp
- pH
- T
- Zusätze
Parameter Protein Löslichkeit
Erhöhung Konodenlänge
- bessere Aufteilung in Phasen
- Proteinlöslichkeit niedriger
- hohere Dichteunterschiede
Verschiebung Kondode zum Ursprung
- niedrigere Konzentrationen für Zusätze nötig, günstiger
- schnellere Auftrennung
- Löslichkeit des Protein sinkt
- hohe Viskosität
PEG Polymer Nucelar Weight
PEG +
- Vorteile: niedrigere Konzentrationen notwending, Materialeinsparung, schnellere Trennung
- Nachteile: stärkere Effekte auf Proteine, weniger Kapazität und schlechtere Verteilung, Viskosität steigt
Parameter pH
- Nettoladung Protein
- verringert Ladungseinfluss auf Verteilung
- ändert Protenhydrophobizität
- verschiebt Ladungsrelation
- beeinflusst Proteinlöslichkeit
Parameter Temperatur
- ändert Phasendiagramm
- niedrige T Einphasigkeit
- Einfluss auf Proteinstabilität
Parameter Additive/Zusätze
umfangreiches Screening notwendig um passendes zu finden
Hinzufügen neutraler Salze führt zu Abschirmung ionischer WW
Selektion ATPS
- Löslichkeit dann Screening beginnen
- Charakterisierung
- Type ATPS
- System Parameter einstellen
Andere Systeme
ATPS pDNA Problematik
Problematik
- gDNA, RNA, pDNA sind chemisch ähnlich, ähnluche Größe, Form, Hydrophobiziztät
- viele Feststoffe im Medium
- schersensitiv
- Reinheitsanforderung
- hohe Viskosität
- schlechte chromatographische Eigenschaften
- Mühen, Zentrifugen, Filtration alle ungeeignet
- nur 2 Phasensystem möglich
pDNA Ablauf
- Homogenisierung
- Zelllyse einleiten
- alkaline Lyse: Zelllyse, Extratktion, Denaturierung, Denaturierung Proteine
- 1 EDTA Zellwand instabilisiern, Inaktivierung abb. Enzyme
- 2 SDS Zellwand verseifen, chem. Aufbruch d Zellwand
- 3 NaOH pH12 Denaturierung
Neutralisierung
- Renaturierung pDNA (pDNA sollte in coiled Form vorliegen)
- Präcipation von Proteinen, Zellstücken, gDNA
Extraktion durch ATPS
- Separation pDNA von gDNA und Protein
- Fest Flüssig Separation
- Isolation
- pDNA recovery + conditioning
- Adsoprtion von pDNA, Entsalzung, Puffer
- Polish und Formulation
- ATPS
- sc pDNA von oc pDNA, gDNA, RNA trennen
- Denaturierung und Renaturierung
- Adsoprtion sc pDNA
- Formulierung und Sterilfiltration
Messung der Methoden
