K3 Zellwandaufschluss

Question 1

Welche mechanischen und nicht-mechanischen Methoden gibt es?

Answer 1

Question 2

Enzymatischer Aufschluss allgemein

Vorteil

Answer 2

• Vorteil: hochselektiv, geringe Produktschädigung, milde Reaktionsbedingungen, keine Zelltrümmerentstehung
• als alleiniger Aufschluss jedoch oft zu schwach

Question 3

Enzymatischer Aufschluss Bakterien

Answer 3

Arten

1. Glucosidasen (lösen Polysaccharidketten)
2. Acetylmuramyl - L- Alaninamidasen (löst die Verbindung von Peptiden und Polysacchariden)
3. Endopeptidasen (lösen Polypeptidketten)

Question 4

Welche Enzyme können beim enzymatischen Aufschluss verwendet werden

Answer 4

1. Labiase: grampos.
2. Lysostaphin: eine Endopeptidase, zerstört Polylycin in Pepidoglycanschicht
3. Lsyozym: Hydrolyse der ß-1,4-Verbindungen Muramin + Glucosamin v.a. grampos, Verbesserung durch EDTA
4. Achromopeptidase; wenn Lysozym nicht wirkt
5. lytische Enzymen (Kitalase is Protease + Pectinase + Amylase)

Question 5

Was kann man sonst noch zum enzym. Aufschluss dazugeben?

Answer 5

1. EDTA: Komplexbildner mit Metallionen (z.B. abbauende Enzyme und LPS, Metallionen aus Geräten), gute Eignung, leicht auswaschbar
2. Thiol: Zerstörung Sulfidbrücken
3. Osmotischer Druck: demin WAsser dazugeben, Diff in Zelle, Zelle platzt
4. Detergent: führt oft zur Inaktivierung des Produkts, Explosionsgefahr

Question 6

Vorgang osmotischer Druck, für welcher Zellen

Answer 6

Zugabe von destilliertem Wasser –> Hypertone Flüssigkeit –> Fl dringt in die Zelle und führt zum Zerplatzen

Funktioniert gut bei Blut und Tierzellen

Nicht bei Pflanzenzellen

Question 7

Ablauf

Answer 7

1 Konzentrierung –> durch Eisbildung wird WAsser entzogen –> Konzentration steigt

2 Osmotischer Gradient bildet sich an Plasmamembran

3 water and heat efflux extrazelluäres auftauen, intrazellulär bleibt es Eis

4 GGW WAsser dringt in Zelle ein (osmotischer Druck)

Ostwaldreifung

aus kleinen Eispartikeln werden große –> Rekristallisation (+ bei leicht st. T)

Rekristallisierung zerstört Zellmembran

schnelles Auftauen: keine Ostwaldreifung

Question 8

Mittel physischer Zerströrung

Answer 8

1. osmotischer Druck
2. Gefrieren
3. Hitze

Question 9

Mechanische Verfahren - Übersicht

Answer 9

Question 10

Ultraschall

Answer 10

akustische Wellen bilden Mikroblasen, Schockwellen gehen durchs Medium

Kavitation = Blasenbildung –> Blasenwachstum –> Blasenzerstörung

kinetische Energie > Wandstärke –> Aufreißen der Zellwand

zusätzliche Scherkräfte durch hohe Geschwindigkeiten neben Blasen

Anwendung: teuer, Dämmung notwending, T+, man erreicht im Tank nicht alle

Question 11

Dekompression

Answer 11

Bsp Parr Bomb

Gas wird ins Wasser gegeben, diffundiert in Zellen, bei plötzlicher Änderung des Drucks wirkt die Zellwand wie eine Diffusionsbarriere (dauert zu lange) –> Zellen zerplatzen

Question 12

French Press

Answer 12

Wirkungsweise

• Zellen in Hochdruck
• Plötzliche Drucksenkung
• Gas in Zelle expandiert während das Medium durch engen Spalt fließt
• Dehnung und Aufriss der Zellwand

Anwendung: Teuer, nicht für alle Zellen geeignet

Question 13

Hochdruckhomogenisator

Funktion, Mechanismen, Parameter

Answer 13

• stationärer (Hochdruck
• Dekompression durch Druckänderung
• Turbulenz am “impact ring”
• Zellflüssigkeit sinkt
• Einsatz abhängig von T, Design, Druck, Durchflussrate, Zellkonzentration
• Anwendung: gern, da hoher Durchsat

Nucelation - Wachstum der Zelle durch Dekompression -Implosion - Explosion

Question 14

Mill

Answer 14

Rotation mit Kugeln –> Aufbrechen beim Aufprall + liquid shear

abhängig von Größe der Glasperlen und Frequenz, Größe der Zellen, Viskosität (bei hoher Viskosität geringere Abnutzung

Gerätedesign

Temperatur steigt, deswegen ist Kühlung notwendig

Viskosität relevant

Rührergeschwindigkeit und Design + verweilzeit ist abhängig von Stärke /Umdrehung

Question 15

Zellaufbruch

Folgen

Entfernung

Answer 15

Zelltrümmer müssen entfernt werden

Grund

• proteolytische Aktivität (da abbauende Proteine freigesetzt)
• Scherkräfte durch hohe Viskosität
• Verstopfung von technischen Geräten

Wie Zelltrümmer entfernen

• Zentrifugation
• Filtration
• ATPS
• EBA
• HGMF

–> Entscheidung durch Wissen zur Verteilung, Ladung und Viskosität

Question 16

Parameter Zellaufbruch

Answer 16

• Produktfreisetzung
• Partikel-/Trümmergröße
• Ladung (zeta potenzial)
• Hydrophobizität
• Viskosität

Trümmergröße

• große Trümmer lassen sich leicher entfernen
• je stärker zersetzt –> Änderung einiger Parameter

Viskosität

• hohe V ist schlecht für den folgenden Prozess
• steigt durch Polymere: DNA, RNA

Zeta Potenzial

• Ladung des Medium ist nicht die Ladung der Zelle
• Zeta potenzial = Ladung kurz unter der Zellwand
• Zellinneres ist basischer als Zelläußeres
• bei höherem Aufschluss steigt der pH Wert (aber grundsätzlich negativ)
• Messung durch Gabe in Elektrisches Feld –> Wanderungsgeschw.

Question 17

Möglichkeiten chemischer Aufschluss

Funktionsweise der einzelnen Gruppen und jeweils ein Bsp

Answer 17

Chelat Agent (EDTA)

• mit EDTA werden oft LPS zerstört

Chaotropic agents (Guadinium)

• Veränderung des WAssers in der Membran
• Membranproteine lösen sich

Surfactans (Trition X)

• hydrophober und hydrophiler Bereich

Solvents

• werden von Zellwandlipiden aufgenommen –> Anschwellen –> Aufplatzen

Synergie/Kombination

Trition X + Guadinium (Guadinium kann auch allein gesetzt werden, aber bei anderen chem. Mittel können geringere niedrigere Konzentrationen)

1. Guadinium zerstört äußere Zellwand –> Trition X dringt weiter zur Inneren Membran
2. Triton X macht die innere Membran löslich

Detergent + Chaotropic –> Solubilize and disrupt

Question 18

Nenne die drei Puffer der alk. Lyse mit Bestandteilen und Funktion

Answer 18

Question 19

5 Parameter mit denen die Güte und Charakteristik eines Zellhomogenats beschrieben werden kann

Answer 19

Question 21

4 Gruppen chemischer ARgentien

Answer 21

1. Chelat agents
2. Solvents
3. Surfactans
4. chaotrophic agents