interaction prot-prot/prot-ADN Flashcards
Qu’est-ce qu’une bio-interaction?
Pourquoi les étudier?
– Les interactions protéine-protéine et
protéine-acides nucléiques
-Régulation, réseaux d’interaction (interactome)
Quelles sont les méthodes in vivo pour étudier les interactions p-p 4
–2 hybride
– Liaisons croisées (crosslinking), TAP
– Transfert d’électrons (FRET)
– Phage display
Quelles sont les méthodes in vitro pour étudier les interactions p-p 5
--Immunoprécipitation/pull down – Co-purifications – Far-Western blot – Liaisons croisées (crosslinking), TAP – Transfert d’électrons (FRET)
Sur quoi se base la méthode 2 hybrides
sur les propriétés de l’activateur transcriptionnelle GAL4 chez les levures
- 2 domaines (activateur/liaison à lADN)
- Lorsqu’il y a interraction des domaines, transcription
- fusion des prot à GAL4
Quels sont les avantages et les désavantages de la méthode 2 hybride
Avantages
-interactions se font à l’intérieure de la cellule
-cout des réactifs
-signal est quantifiable
Désavantages
-faux négatives et faux positives
-réactions se font dans des levures: glycosylation
-faut faire des clonages pour fusionner les protéines
Sur quoi se base le crosslinking?
- produits chimiques peuvent réagir avec les extrémités N- ou C- des prot.
- contiennent 2 régions réactives
- Si 2 protéines sont proches, on devrait être capable de les ‘lier’ ensembles
À quoi sert les cleavable?
avec ces produits, on peut cliver les protéines liées
ensembles pour inverser les
liaisons croisées (crosslinking)
Sur quoi se base le phage display?
Détection des interactions p-p avec la capside du phage M13 Librairie aléatoire de peptides produits comme protéines de fusion au capside du M13 Protéine à étudier collée à une plaque 96-puits Liaison des phages, lavages, élution, répéter 2 fois suivi par la séquençage de l’ADN isolé des phages
sur quoi se base la Fluorescence resonance energy transfer?
Basé sur les propriétés des protéines fluorescentes.
Si les 2 protéines sont proches, émission de la lumière
Vrai ou faux;
On peut faire les réactions de FRET in vitro ou in situ
vrai
On peut faire les réactions de FRET in vitro en solution (lecture dans un spectromètre à fluorescence) ou in situ (microscope à fluorescence)
Sur quoi se base la méthode TAP
-Protéine fusionnée à 2 ‘tags’ d’affinité -Mélangé à protéines cellulaires in vitro ou exprimé in vivo -Purification par billes d’affinité -Coupure par protéase -2e purification par 2e tag d’affinité -Élution et identification des protéines par spectrométrie de masse
Sur quoi se base la méthode pull-down?
si 2 protéines réagissent ensemble, et si on purifie 1 de ces protéines, l’autre suivra. -Pull down avec protéine taggée (6his, GST, MBP etc), Tag introduit à une extrémité de la protéine par clonage -Protéine taggée exprimée et purifiée in vivo ou in vitro -Mélangée avec la protéine interactrice in vitro -purifiée
Sur quoi se base le farwestern blotting
Détection des interactions entre 2 protéines sur un membrane:
isole 1er sur une membrane, incubation avec la 2e prot marquée
Quelles sont les méthodes in vivo pour étudier les interactions p-ADN 2
-One hybrid/fusions aux promoteurs
– Immunoprécipation du chromatin (ChIP)
Quelles sont les méthodes in vitro pour étudier les interactions p-ADN 5
-Liaison aux filtres – Chromatographie à affinité à l’ADN – Southwestern blot – Retard sur gel (EMSA) – Empreinte sur l’ADN (footprinting)
