interaction prot-prot/prot-ADN Flashcards
Qu’est-ce qu’une bio-interaction?
Pourquoi les étudier?
– Les interactions protéine-protéine et
protéine-acides nucléiques
-Régulation, réseaux d’interaction (interactome)
Quelles sont les méthodes in vivo pour étudier les interactions p-p 4
–2 hybride
– Liaisons croisées (crosslinking), TAP
– Transfert d’électrons (FRET)
– Phage display
Quelles sont les méthodes in vitro pour étudier les interactions p-p 5
--Immunoprécipitation/pull down – Co-purifications – Far-Western blot – Liaisons croisées (crosslinking), TAP – Transfert d’électrons (FRET)
Sur quoi se base la méthode 2 hybrides
sur les propriétés de l’activateur transcriptionnelle GAL4 chez les levures
- 2 domaines (activateur/liaison à lADN)
- Lorsqu’il y a interraction des domaines, transcription
- fusion des prot à GAL4
Quels sont les avantages et les désavantages de la méthode 2 hybride
Avantages
-interactions se font à l’intérieure de la cellule
-cout des réactifs
-signal est quantifiable
Désavantages
-faux négatives et faux positives
-réactions se font dans des levures: glycosylation
-faut faire des clonages pour fusionner les protéines
Sur quoi se base le crosslinking?
- produits chimiques peuvent réagir avec les extrémités N- ou C- des prot.
- contiennent 2 régions réactives
- Si 2 protéines sont proches, on devrait être capable de les ‘lier’ ensembles
À quoi sert les cleavable?
avec ces produits, on peut cliver les protéines liées
ensembles pour inverser les
liaisons croisées (crosslinking)
Sur quoi se base le phage display?
Détection des interactions p-p avec la capside du phage M13 Librairie aléatoire de peptides produits comme protéines de fusion au capside du M13 Protéine à étudier collée à une plaque 96-puits Liaison des phages, lavages, élution, répéter 2 fois suivi par la séquençage de l’ADN isolé des phages
sur quoi se base la Fluorescence resonance energy transfer?
Basé sur les propriétés des protéines fluorescentes.
Si les 2 protéines sont proches, émission de la lumière
Vrai ou faux;
On peut faire les réactions de FRET in vitro ou in situ
vrai
On peut faire les réactions de FRET in vitro en solution (lecture dans un spectromètre à fluorescence) ou in situ (microscope à fluorescence)
Sur quoi se base la méthode TAP
-Protéine fusionnée à 2 ‘tags’ d’affinité -Mélangé à protéines cellulaires in vitro ou exprimé in vivo -Purification par billes d’affinité -Coupure par protéase -2e purification par 2e tag d’affinité -Élution et identification des protéines par spectrométrie de masse
Sur quoi se base la méthode pull-down?
si 2 protéines réagissent ensemble, et si on purifie 1 de ces protéines, l’autre suivra. -Pull down avec protéine taggée (6his, GST, MBP etc), Tag introduit à une extrémité de la protéine par clonage -Protéine taggée exprimée et purifiée in vivo ou in vitro -Mélangée avec la protéine interactrice in vitro -purifiée
Sur quoi se base le farwestern blotting
Détection des interactions entre 2 protéines sur un membrane:
isole 1er sur une membrane, incubation avec la 2e prot marquée
Quelles sont les méthodes in vivo pour étudier les interactions p-ADN 2
-One hybrid/fusions aux promoteurs
– Immunoprécipation du chromatin (ChIP)
Quelles sont les méthodes in vitro pour étudier les interactions p-ADN 5
-Liaison aux filtres – Chromatographie à affinité à l’ADN – Southwestern blot – Retard sur gel (EMSA) – Empreinte sur l’ADN (footprinting)
À quoi sert la méthode one hybrid
de trouver les protéines capable de lier à une séquence cible
Comment fait-on la méthode one hybrid?
- Cloner la séquence de liaison à coté d’un gène rapporteur
- Introduire librairie de clones exprimant les protéines
- Protéine lie à la séquence cible=transcription du gène marqueur
Sur quoi se base la méthode liaison au filtre
-Les protéines s’attachent aux filtres de nitrocellulose
• L’ADN marqué traverse le filtre, sauf si se lie à une protéine
• Quantifiable (décompte de radioactivité)
Qu’est-ce qu’un southwestern blot?
Combinaison d’un Western blot (protéines fixées à un membrane) avec un sonde d’ADN marqué
Sur quoi se base un southwestern blot?
la domaine de liaison à l’ADN peut rénaturer sur une
membrane de nitrocellulose pour permettre une liaison d’un ADN spécifique marqué
Quels sont les défaults des southwestern blot
-Faut éviter les interactions nonspécifiques
• Faut être sur qu’il y a eu une rénaturation complète.
Sur quoi se base les gelshift ou EMSA
Liaison de protéine retarde la migration d’un ADN marqué
• Une fois dans le gel, les complexes peuvent s’associer et se re-associer in situ
-Utile pour suivre la purification d’une protéine liante à l’ADN
Comment assurer la spécificité de l’interaction? 3
-Ajout de l’ADN nonspécifique en excès
• Expérience témoin avec un fragment nonspécifique marqué ou fragment spécifique muté
• Compétition avec un ADN spécifique et un ADN nonspécifique
Comment peut-on déterminer le lieu de l’interaction de la protéine avec l’ADN?
Méthode de gelshift
-Le plus grand degré de courbeture sera avec
un site de liaison centralisé
-migre le moins dans le gel.
À quoi sert la méthode essais de protection? 2
- définir les contactes entre la protéine et l’ADN
- possibilité de voir plusieurs sites de liaison et de mésurer la coopérativité
Quel sont les précautions à prendre avec la méthode d’essais de protection? 4
1) L’ADN devrait être marqué à une extrémité et sur un brin seulement
2) Modifications ou coupures une fois par molécule
3) modifications/coupures aléatoires (pas spécifique pour une séquence)
4) Liaison de protéine devrait reduire les modifications/coup.
